Case Studies离心柱法 | 大肠杆菌RNA提取

实验所用试剂设备清单

实验前准备

1．自备设备和试剂：台式离心机、振荡仪、水浴锅或金属浴，1.5 mL RNase-free 离心管，无水乙醇等。

2．首次使用前，在漂洗液W*瓶中加入4倍体积的无水乙醇，充分混匀后使用，并做好标记。如果发现漂洗液W*由于运输或保管不当造成容量严重不准，请用量筒定容后再加入4倍体积的无水乙醇。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持漂洗液W*中的乙醇含量。

3．首次使用前，称取1 mg溶菌酶（19301-A，产品货号：10402ES）溶于1 mL缓冲液TE(pH 8.0)，充分混匀，即为1 mg/mL溶菌酶工作液。工作液分装-20℃保存，数周内稳定。

操作步骤

1．取1 mL大肠杆菌培养液（约5×105），12000 rpm离心2 min，弃上清。注：菌体不宜过量，过量会严重降低产量。起始处理量与细菌密度、种类等相关。注：上清残留量不宜超过20 μL。

2．针对革兰氏阴性菌：加入100 μL 1mg/mL溶菌酶工作液。涡旋振荡10 sec，室温孵育2 min。重复振荡孵育3次。

3．短暂离心收集细胞，弃上清。

4．涡旋振荡重悬分散细胞。加入500 μL裂解液LB，反复吹打混匀，并剧烈涡旋振荡至无明显不溶物。注：若处理后，仍有不溶物，可12,000 rpm离心2 min，取上清液进行下一步。

5．将DNA清除柱B4套入2 mL收集管中，备用。

6．加入上述裂解物至DNA清除柱B4中，12000 rpm离心1 min，保留滤过液。注：离心后，若滤膜仍有液体残留，可延长离心时间至5 min。

7．加入250 μL无水乙醇，立即吹打混匀。注：可能会形成絮状沉淀，属于正常现象。

8．将上述混合物加入RNA吸附柱B4中，12000 rpm离心1 min，弃掉废液。注：混合液每次最大加入体积700 μL，可分多次离心。

9．加入500 μL去蛋白液PL，12000 rpm离心30 sec，弃掉废液。

10．将RNA吸附柱B4放回收集管中，加入500 µL漂洗液W*，12000 rpm离心30 sec，弃废液。注：确保漂洗液W*已添加无水乙醇。重复一遍步骤10。

11．将RNA吸附柱B4放回收集管，空柱12000 rpm室温离心2 min，以除去残留的漂洗液W*。

12．将RNA吸附柱B4放入新的1.5 mL RNase-free离心管中，在RNA吸附柱B4中央加入50 µL RNase-free H2O，室温放置1 min。然后12000 rpm离心1 min。收集滤液，即为RNA溶液。

13．样品可置于-20℃短期保存，-80℃长期保存。

质检结果—RNA浓度和纯度

质检结果—RNA完整度分析

数据来源：北京某高校老师

实验结论

采用翌圣生物离心柱法细菌RNA提取试剂盒（19301ES50）提取8个大肠杆菌样本，通过Nanodrop检测RNA的浓度和纯度、琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整度，结果显示：提取的大肠杆菌RNA浓度较高（除第一个样本由于操作失误降解），其余7个样本完整度较好，28S：18S大约2：1，能够满足后续RNA-seq要求。