克隆FAQ

酶切（包括单酶切和双酶切，建议双酶切降低质粒载体自连概率）或反向PCR。

载体使用量应大于 0.01 pmol，推荐使用量 0.03 pmol；克隆载体与目的片段摩尔比应在 2:1-1:5 范围内，最适为 1:2-1:3，超过范围可能会影响克隆效率。

会。线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应，会产生较高的假阳性或抑制反应。建议割胶回收纯化产物。

可以用，线性化载体是通过反向PCR 方式制备。氨苄抗性。不提供终载体。

最小建议 100bp 以上，过短的片段可能会被核酸外切酶完全切除掉。最大 10kb， 一般片段越大，难度系数更高些。

不是必需搭配。推荐使用转化效率为 107 cfu/μg 以上的感受态细胞。如 Yeasen的 DH5α（cat NO. 11802ES），TOP10（cat NO. 11801ES）等。可以电转，但要用电转感受态。

可以用。常用多顺反子元件载体，将多个 ORF 串联起来，同时表达多个基因。而 IRES 元件和 2A 多肽元件是最常用的。

同源重组酶兼具外切酶活性、DNA 聚合酶活性及连接酶活性。a）外切酶活性：该酶能特异性地识别载体和插入片段末端的 15-20bp 的同源序列， 并沿着 5'→3'方向切割dsDNA，从而产生粘性末端，粘性末端的碱基在 50℃作用下进行互补配对，将具备同源序列的载体与插入片段“融合”。b）DNA 聚合…

优势：a）无需考虑酶切位点：不受插入片段酶切位点限制，适用于任何载体；插入片段兼容粘性或平末端。b）设计简单：在插入片段的 PCR 扩增引物 5’端引入 20 bp 左右与载体末端同源的序列即可。c）快速：50℃，20 min 即可完成重组。d）应用广泛：可用于单片段或多片段定向克隆，也可结合Can…

a）少了对目的片段酶切和回收步骤，且连接反应无需过夜，只需 20 min，相当于省去一天时间。b）不用考虑酶切位点是指载体可以选择任意酶切位点进行线性化，无需考虑目的片段上是否含有相同的酶切位点。

可以的，X-α-Gal易溶于DMF和DMSO，酵母杂交实验常使用DMF溶解。。

化学结构不一样，但都可以用于GUS活性的检测，根据个人使用习惯选择即可。

可以的。X-Gluc 是 β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的通用显色底物，GUS 水解底物后产生深蓝色沉淀，只要目标菌种表达具有 β-葡萄糖醛酸酶活性的酶即可显色，并非大肠杆菌专属。

不可以，不包含用于蓝白斑筛选的β-半乳糖系统。TOPO克隆主打的就是快速，阳性率高，所以一般不需要进行蓝白斑筛选。

不可以。Topo载体进行连接反应的时候需要5'羟基端和Topo酶发生反应。PCR产物5'羟基端没有磷酸化，可以直接进行TOPO克隆。但是，酶切产物5'端为磷酸化状态，可以直接进行TA克隆的，但是不能进行Topo克隆。如果需要，可以用小牛肠碱性磷酸酶（10321ES）进行去磷酸化处理后连接Topo载体…

建议反应体系应控制在10 μL内，体系太小连接会受到影响。如果目的基因浓度太低，建议浓缩之后再连接，以提高连接成功率。插入片段使用量参考说明书。连接反应不可于冰上进行。室温（20-37℃）下孵育时，建议孵育时间不超过5 min，如果PCR产物浓度较低或者片段较长，则可以适当延长孵育时间，不宜超过15…

试剂盒中的载体为氨苄抗性。

推荐氨苄抗生素浓度为100μg/ml。

Topo 载体进行连接反应的时候需要 5`羟基端和 Topo 酶发生反应。PCR 产物 5`羟基端没有磷酸化， 可以直接进行 TOPO 克隆。但是，酶切产物 5`端为磷酸化状态，可以直接进行 TA 克隆的，但是不能进行 Topo 克隆。如果需要，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）进行去磷酸化处理后连接…

建议反应体系应控制在 10μl 内，体系太小连接会受到影响。如果目的基因浓度太低，建议浓缩之后再连接，以提高连接成功率。插入片段使用量参考说明书。一般 1-2min 即可完成连接反应，若想得到更多克隆，可适当延长至 5min，但不能超过 5min。室温反应即可。