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Q:11202ES预变性 5 min 调整成了 10min,对于实验结果有影响吗?

有影响,预变性时间较长可能会影响酶的活性,导致 PCR 产物的产量有所降低。Q:qPCR 实验结果的有效性?为什么建议Ct 值要大于 15?有效性要满足三个条件:(1)标准曲线:扩增效率范围:90-110%,对应斜率为 -3--3.5。 R2>0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1),当斜率=…

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Q:11184ES试剂比较粘稠,容易产生气泡,如何避免?

可以先混合大体系,再分别加到离心管里面,最后加模板;枪头加样不要把空气打进去,二档吸样,一档打样品;缓慢推出液体,不要吹打;沿着壁打入到孔内;另外配置完后,如果还有气泡,离心PCR管去除。如果是96孔板,移液完后轻轻敲96孔板。

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Q:11185ES试剂比较粘稠,容易产生气泡,如何避免?

可以先混合大体系,再分别加到离心管里面,最后加模板;枪头加样不要把空气打进去,二档吸样,一档打样品;缓慢推出液体,不要吹打;沿着壁打入到孔内;另外配置完后,如果还有气泡,离心PCR管去除。如果是96孔板,移液完后轻轻敲96孔板。

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Q:11198ES模板用量X 是多少?常用的量是多少?

(1)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释(一般推荐 5-10 倍),然后模板量梯度上样,选择 CT 值落在 20-30 之间的最佳上样量。(2)常用的量是逆转录 500-1000ng 总RNA,稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行qPCR 实验…

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Q:11198ES qPCR 实验结果的有效性?为什么建议Ct 值要大于 15?

(1)有效性要满足三个条件:(1)标准曲线:扩增效率范围:90-110%,对应斜率为-3--3.5。R2>0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1),当斜率=-3.32 时,扩增效率=100%。(2)扩增曲线:S 型曲线,且 Ct 值在 15-35 之间,阴性对照 Ct>35 或无Ct 值。(3)…

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Q:11198ES为什么扩增曲线不稳定(扩增曲线平台期锯齿状)?

可能原因:a)RNA 纯度低,体系中存在较多杂质;推荐参数:OD260/OD280=1.8-2.0, OD260/OD230>2.0。随着 qPCR 反应的进行,阻碍反应的因素不断增加,若 RNA 纯度低,杂质多,会进一步影响仪器平台期的算法,导致出现锯齿状。b)仪器长时间未做校准。仪器未校准会使仪…

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Q:11198ES为什么扩增曲线无法达到平台期?

可能原因:a)模板量太低(CT 值 35 左右)。推荐 Ct 值:15<Ct<30。原因:Ct 值太大(如 Ct>30),刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应,故无法到达平台期。 b)循环次数太少(30 cycles);循环次数过少(如 35)导致刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应,故无法到达平…

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Q:11198ES为什么出现双峰,并且较低峰 Tm 在 80℃之前?

较低峰 Tm 在 80℃之前可能原因:存在引物二聚体(一般mRNA 反转录后定量,产物在 100-150bp 左右,峰对应 Tm 值为 80-90℃。若有引物二聚体存在,引物二聚体大小只有几十bp,峰对应 Tm 值在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现一个峰, 80℃以后出现一个峰),模板浓度…

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