应用方向DNA/RNA核酸提取过程中常见问题

1. A260/280比值较低？或者A260/280比值较高？

用水作为洗脱液比较偏低，或者蛋白质残留，但如果操作过程中使用了苯酚，则更可能是苯酚残留。而比较高可能是大量RNA残留，没有使用RNaseA，或RNaseA活性下降。

2. 提取的细菌基因组DNA有降解，为什么？

确认选用的培养菌体是否新鲜，如果菌体需要保存时，请于-80℃保存。

起始菌液量过多，导致菌液裂解不充分，部分DNA降解。

菌体本身富含DNA酶活性，加入Digestion solution后再加20ul 0.5M EDTA溶液来抑制内源性核酸酶

3.提取的基因组DNA生物活性差，为什么？

提取的基因组DNA中盐分浓度过高，请严格按照说明书操作。

提取的基因组DNA中含有乙醇。离心的速度和时间应该严格遵循说明书要求进行。

4.碱裂解法提取的质粒DNA进行琼脂糖电泳进行鉴定时，看到的三条带分别是什么？

碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，得到的三条带是以电泳速度的快慢排序的，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。

5. 为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊醇？

在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

1. 冻存细胞与新鲜细胞的RNA提取有区别吗？具体该怎么操作？

新鲜细胞与冻存细胞RNA提取没什么区别。直接把Trizol直接加到冻存管了，一起化开，振荡振荡就可以了。与从组织中提RNA 差不多。

2. RNA得率低

• 有的组织或者细胞中RNA含量偏低：不同细胞和组织中RNA的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织(总RNA含量2-4μg/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织(总RNA含量<0.05μg/mg)。

• 组织起始量太少或者太多：样品量过少，则细胞组织中RNA含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致RNA得率低。

3. RNA降解

• 提取的材料不新鲜。新鲜组织取得后应立即置于液氮中或立即放入RNAstore试剂中，以保证提取效果。

• 处理样品量过大。

• 污染了RNase。虽然试剂盒中提供的缓冲液都不含RNase，但使用过程中很 容易污染RNase，应小心操作。

4. OD260/OD280比值偏低

• 蛋白质污染/苯酚残留：用Triol提取时确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。

• 多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。

• 设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。

5. RNA中有基因组DNA污染

• 材料中核酸含量高：脾脏、胸腺等组织中的核酸含量较高，可进行多次酚/氯仿抽

• 提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 处理，降解 DNA。

• 材料过量：增加试剂用量。

• RNA 沉淀条件不合适：使用异丙醇沉淀 RNA 时，加入的异丙醇与提取液的比例偏高。

• 溶液的 pH 值偏小，都容易使 DNA 形成沉淀。