Techniques分子克隆中产生突变的原因
在分子克隆实验中，突变几乎是难以完全避免的问题。有时是某个碱基发生了替换，有时则会出现大片段的缺失或重排。这些突变不仅影响实验结果的可重复性，有时甚至会让我们在筛选阳性克隆时耗费大量时间。结合实验经验来看，突变主要来源于四个方面：细胞增殖过程中的自发突变、DNA序列自身的不稳定性、实验操作中的紫外线损伤，以及PCR扩增过程引入的错误。下面分别梳理它们的成因、
Techniques同源重组克隆，为什么板子上一个克隆都没有或克隆数很少？
做分子克隆的朋友，大概都经历过这样的时刻：小心翼翼做完同源重组连接，涂板，第二天满怀期待地去看——板子上干干净净，一个克隆都没有，或者就零零散散长几个，克隆特别少。今天和大家一起，像复盘实验一样，把那些可能导致“零克隆/克隆少”的原因过一遍。下次遇到同类问题能快速排查原因。1. 引物设计：同源臂设计不理想同源臂是重组反应中识别与定位的关键序列，其设计质量直接
Techniques上样量、电压与电泳时间的优化策略：针对不同长度片段的电泳条件Q&A
核酸电泳是进行核酸研究的重要手段，是分离、鉴定和纯化核酸的主要方法。琼脂糖凝胶电泳因其分离范围较广，在实验中应用更为广泛。然而，电泳过程中常常会遇到各种问题，如条带不清晰、弥散、弯曲等。本文将针对上样量、电压与电泳时间这三个关键参数，结合不同长度DNA片段的特点，提供详细的优化策略。一、上样量的优化策略Q1：如何确定合适的上样量？上样量是影响电泳结果的关键因
Techniques反转录后cDNA可保存多久？与反转录试剂有直接关系吗？
在分子生物学实验中，反转录得到的cDNA需要妥善保存以确保后续实验的可靠性。关于cDNA能存放多久，以及反转录试剂的选择是否会影响其稳定性，本文将结合实测数据为实验室标准化操作提供参考。cDNA产物短期保存短期保存条件：4°C短期保存1-7天根据一些主流试剂厂商的技术规范，大部分厂商的cDNA合成产物可在4℃放置1~3天，这一时间窗口适用于实验流程紧凑、需连
Techniques逆转录实验经典灵魂拷问：到底要不要去除基因组DNA？
宝子们平时购买逆转录试剂盒的时候是不是销售都会问这么一个问题：咱们要不要去除基因组呢？这个时候你是不是也会开始思索到底要不要呢？好像以前购买的都是要去除的，那为啥要去除，不去除会咋样呢？今天咱们就从头到尾梳理一下基因组DNA是啥？为啥会存在于提取的RNA中？基因组DNA（gDNA）是生物体遗传信息的完整载体，包含所有编码和非编码序列。它存在于提取的RNA中，
Techniques逆转录试剂中的RNase抑制剂作用是什么？
说到逆转录试剂我们先来说说逆转录实验什么是逆转录？A：以RNA为模板，合成cDNA的过程。逆转录实验需要哪些要素呢？模板引物逆转录酶BufferdNTPsRNA酶抑制剂无核酸酶水关于模板，引物，逆转录酶，Buffer,dNTP这些，大家都非常明确，是作为反应过程中的要素而存在的，那RNA酶抑制剂是干什么用的呢？RNA酶抑制剂的作用是与RNase以非共价键结合
TechniquesT4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase)实战指南：常见问题排查
T4 DNA Ligase是分子克隆中使用频率最高的工具酶之一，但在日常实验中，从连接、转化到筛选，几乎每个步骤都可能遇到问题。本文整理了高频的T4 DNA Ligase实验问题，提供可操作的排查思路和解决方案。Q1：连接后转化，平板上一个菌落都没有，怎么办？这是最常见的"灾难性问题"，建议按照以下优先级逐项排查：· 抗生素是否正确：确认平板抗生素种类与载体
Techniques巨噬细胞清除 | 第十一课：BALB/c小鼠巨噬细胞清除
BALB/c小鼠其本身乳腺肿瘤自然发生率低，但用乳腺肿瘤病毒诱发时发病率高；卵巢、肾上腺和肺的肿瘤在该小鼠有一定的发生率，易患慢性肺炎，对放射线甚为敏感。与其它近交系相比，肝、脾与体重的比值较大。20月龄的雄鼠脾脏有淀粉样变。另外有自发高血压症，老年鼠心脏有病变，雌雄鼠均有动脉硬化。对鼠伤寒沙门氏菌补体敏感，对麻疹病毒中度敏感。对利什曼原虫属、立克次氏体和百
Techniques不止于胆固醇：低密度脂蛋白LDL在肥大细胞诱导中的关键使命
肥大细胞（mast cell）又称组织嗜碱细胞，与嗜碱性粒细胞共同起源于骨髓造血干细胞。血液循环中存在的祖细胞在局部特定因素（如干细胞生长因子、IL-3等）的刺激下进一步发育成为成熟的肥大细胞。肥大细胞在多种疾病的发病机制中发挥关键作用，包括过敏性和自身免疫性疾病，支持这些观点的大多数事实来自动物疾病模型，特别是肥大细胞缺陷小鼠模型。相比之下，肥大细胞在人类
Techniques为什么CQ氯喹处理后的细胞使用溶酶体探针染色反而更亮
染色示例图1、用共聚焦显微镜观察在10% FBS 、Pristane或氯喹 (CQ，30μM) 处理20 小时的RAW264.7 细胞中的溶酶体，溶酶体使用LysoTracker Green DND26（50 nM）和Hoechst 33342（5 µg/ml）进行染色[1]。图2、用共聚焦显微镜观察在对照、Baf A1 (100nM，5h) 、CQ（100
TechniquesRNA的二级结构如何成为影响逆转录效率
在进行RT-qPCR实验过程中，逆转录实验是将RNA信息“逆向”转录为cDNA的关键步骤，属于一个承上启下的实验过程，被广泛应用于基因表达分析、病毒研究和RNA测序等领域。然而，这个看似成熟的流程，实则隐藏着一个容易被忽视却又至关重要的变量——RNA自身的二级结构。1.什么是RNA二级机构？由分子内碱基配对形成的局部发夹、茎环乃至更复杂的空间折叠都可以称之为
Techniques反转录核心原理详解
逆转录（Reverse Transcription）是我们破译基因表达信息的核心工具之一。无论是做qPCR看基因表达量，还是做基因克隆，第一步都是将不稳定的RNA“翻译”成稳定的cDNA——这个过程的成败，直接决定了后续实验的走向。今天，就带大家深入理解逆转录的原理，并梳理那些决定实验成败的关键因素。一、逆转录的本质：一场“反向”的信息传递在经典的“中心法则
Techniques攻克扩增难题高GC含量，复杂二级机构，长片段的终极方案
做PCR最怕什么？模板GC含量高非常难打开，二级结构复杂怎么都扩不出，或者片段太长跑出一条弱带甚至什么都没有——这些场景遇上一个就够头疼了。Hieff Canace® Veritas Long PCR Master Mix（10166ES） 就是为这些"困难户"量身打造的终极方案。🎯三大硬核能力，专治疑难模板🔥 长片段：DNA 40 kb / cDNA 14
Techniques提高cDNA长度与产量的5个核心技巧
做反转录（RT-PCR）时，最令人沮丧的莫过于：明明提的RNA质量很好，跑胶也看到清晰的条带，但做出来的cDNA要么浓度极低，要么全长基因永远扩不出来。其实，cDNA的长度和产量，并不只取决于RNA质量，更多取决于你对反转录酶“脾气”的拿捏。以下是经过实战检验的5个技巧，帮你把cDNA的“质”和“量”都拉满。1. RNA的二级结构是长cDNA的头号天敌想要获
TechniquesPCR防污染利器：dUTP/UDG体系原理与应用详解
——从气溶胶污染的分子机制到防污染体系的完整实施方案
Techniques去糖基化酶助力糖蛋白和抗体糖型分析（去O-糖基化版）
背景介绍随着糖蛋白质组学和抗体药研究的迅速发展，糖基化修饰也备受关注。细胞与细胞、细胞与病原体的接触主要是通过糖与蛋白质相互作用完成的，糖基化决定了糖复合物的粘附特性。蛋白质糖基化是蛋白质在翻译后通过糖基转移酶将糖链共价连接到特定氨基酸残基上的修饰过程，依据糖链与蛋白质连接的化学键类型及连接位点的不同，糖蛋白被分为N-连接糖蛋白、O-连接糖蛋白、C-连接糖蛋
Techniques植物叶片RNA建库全解析
在植物分子生物学研究中，RNA建库是连接样本与测序分析的关键桥梁，也是解析基因表达、挖掘功能基因及探索生长发育机制的重要环节。植物叶片作为光合作用的主要器官，其RNA质量直接决定了转录组分析、基因克隆以及差异表达研究的可靠性。然而，叶片样本中富含多糖、多酚等杂质，且RNA极易被RNase降解，这给建库工作带来了不小的挑战。本文将全面解析植物叶片RNA建库的核
TechniquesUniPhi29 DNA Polymerase常见问题解答
本文系统汇总翌圣 UniPhi29 DNA Polymerase（货号 14417ES）全流程技术疑问、故障解决方案、实验优化方案与配套试剂搭配建议，覆盖选型、引物设计、体系配制、扩增反应、产物处理、储存质控、下游测序全环节，一站式解决 MDA、RCA 等温扩增实验各类问题。Q1: UniPhi29（14417ES）与翌圣现有phi29（14404ES）有什
Applications蛋白纯化介质——快速选择高效的纯化树脂
对目的蛋白的功能、结构和相互作用研究时，常常会用到蛋白纯化介质。Yeasen为您提供多种优良的亲和层析介质，可批量或利用重力进行纯化，可以高效、便捷、可靠地从您的样品中分离蛋白和抗体，为下游应用提供良好保证。
ApplicationsRIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液
RIPA裂解液，读这些就够了！
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