TechniquesWestern blot所必须的内参及标签抗体

何为内参抗体、何为标签抗体？

一、内参抗体

内参即内部参照（Internal Control），类似于荧光定量实验的内参基因，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由看家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在不同组织和细胞中的表达相对恒定，常用它作为检测目的蛋白表达水平变化时来做参照物。

1. 内参抗体的功能：

（1）检测整个WB流程是否正常

（2）检测基因表达产物是否正确

（3）比较表达产物微量的相对变化

（4）评价各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致

2. 内参抗体的选择：

（1） 样本种属来源

l 哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、NaK、Atpase等。

l 植物来源实验样本，则可以选择plant actin、Rubisco等。

l 根据来源样本选择不同的内参，是WB实验成功的关键。也可参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参。

（2）目的蛋白分子量

选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5 KD以上。比如目的蛋白分子量为45 KD，此时不适宜选择β-actin（43 KD）作为内参，可以考虑选择GAPDH或者β-tubulin作为内参。

（3）内参蛋白的表达部位

图1. 不同部位内参蛋白展示图

二、标签抗体

标签抗体的组成一般分为蛋白标签和目的蛋白两部分。标签抗体的合成主要是将蛋白标签是利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。标签抗体（Tag Antibody）可用于检测和纯化各种商品化表达载体上的标签序列，分析目的蛋白的表达含量及其功能。其原理是抗原—抗体反应，这些标签抗体可以高度特异地结合对应的标签融合蛋白。

标签抗体的选择可遵循以下原则：

l 检测蛋白A+His标签，选择抗His抗体；检测蛋白B+MBP标签，选择抗MBP抗体；

标签抗体是开展基因蛋白表达、信号转导和基因功能研究的常用工具。随着技术的不断发展，相继开发得到具有各种不同功能的蛋白标签，常见的蛋白标签有His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP 等。

表1. 不同标签功能介绍

三、翌圣标签抗体与内参抗体

标签抗体

内参抗体

其他常用内参类型推荐

四、标签抗体标记的蛋白纯化产品

1. Anti-Flag亲和纯化凝胶

Anti-Flag亲和纯化凝胶由高质量的鼠源 IgG2b单克隆抗体与Sepharose 4B gel 通过供价偶联制备，本产品具有较高的Flag标签融合蛋白加载容量（至少为1.1mg protein/ml gel），杂蛋白非特异结合少，可用于蛋白质免疫沉淀（IP）和蛋白质纯化。

Anti-Flag亲和纯化凝胶可结合Met修饰的N端Flag融合蛋白（Met-FLAG–Protein），N端Flag 融合蛋白（FLAG–Protein），C端Flag 融合蛋白（Protein-FLAG）。

图2. Anti-Flag亲和纯化凝胶IP后蛋白电泳图

1, 国外品牌 2,Yeasen；抗体浓度：7.5mg抗体/ml凝胶；蛋白结合量：1.25mg蛋白/mL凝胶；蛋白纯度：＞95%

图3. 不同品牌Flag凝胶价格比对图

2. 琼脂糖凝胶偶联标签抗体

琼脂糖凝胶偶联标签抗体由高质量的鼠源单克隆抗体与Sepharose 4B gel 通过供价偶联制备，具有较高的标签融合蛋白加载容量，杂蛋白非特异结合少，可用于蛋白质免疫共沉淀和少量蛋白质纯化。

3. 标签多肽

蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。Yeasen公司推出的标签多肽可用于与带有相应标签的蛋白竞争性结合anti-标签单抗，以达到纯化标签融合蛋白的目的。