技术讲解WB运动会之足球赛篇：实验全流程大体验！

【协会介绍】

RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

测试局一：BCA法测定蛋白浓度（20201ES）

图1. BCA测定蛋白浓度原理

【检测方式】

标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

图2. BCA样本的微孔板加样及检测流程

测试局二：Bradford法测定蛋白浓度（20202ES）

图3. Bradford法测定蛋白浓度原理

【检测局简介】

检测原理是考马斯亮蓝(Coommassie Brilliant Blue)G-250与蛋白质的碱性和芳香族氨基酸特别是精氨酸(Arginine)在酸性介质中结合后，溶液转变为蓝色，溶液最大吸收峰从465nm迁移到595nm，颜色的变化与蛋白质浓度成正比。

选择方式一：满足多浓度同时制备（翌圣20328号场地）

选择方式二：单浓度专一性制备（翌圣20324-20327号场地）

图4. PAGE凝胶配置流程简略图

选择方式三：预制胶产品，无需制备，即拆即用（翌圣36245-36256号场地；附带Marker：20350-20352）

图5. 预制胶样图及蛋白marker

【场地其他硬件】

其他的缓冲液成分

(1）电泳缓冲液：10×Tris-Glycine-SDS电泳缓冲液（20319ES76），或参考配方（1×）：25 mM Tris, 192 mM Glycine，0.1% SDS, pH 8.3；

(2）电转缓冲液：Western Blot电泳电转通用缓冲液（20329ES03），或参考Tris-Glycine缓冲液配方；

(3）蛋白上样缓冲液：5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（20315ES05），或参考配方1×：0.25MTris-HCL（pH6.8）, 10%（W/V）SDS, 0.5%（W/V）BPB（溴酚蓝）, 50%（V/V）甘油，5%（W/V）β-巯基乙醇（2-ME）/DTT。

热身项目一：短距离有氧远动

运动实时检测员：转膜缓冲液（20329ES03）

图6. 蛋白胶转膜过程简介

【热身注意事项】

大蛋白（>100kDa）和小蛋白（<100kDa）的转膜小技巧

（1）大蛋白易在凝胶里形成沉淀，从而影响转膜，在转膜缓冲液中加入0.1% SDS，可增加蛋白的溶解性，避免上述情况的发生；由于甲醇易使SDS从蛋白 上脱离，因此，可通过降低甲醇的浓度（低至10%或更低）来防止蛋白沉淀。

（2）由于SDS能够阻止蛋白与膜的结合，因此在对小蛋白转膜时可不加SDS，同时甲醇浓度可增加至20%。

热身项目二：守门员的封闭专项练习，拒绝一切非特异性抗原

守门员（封闭大使）：BSA（选手：36101-36106）、脱脂奶粉（选手：36120）、动物血清（选手：36116-36119）、快速封闭液（选手：36122）

进攻球员：非特异性抗原。

图7. 膜的封闭原理

【热身注意事项】

并不是所有的实验都可用脱脂奶粉作为封闭液：

1. 脱脂奶粉因含有生物素，不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用；

2. 脱脂奶粉中因含有磷酸酶，可使膜上的磷酸化蛋白去磷酸化，因此不能用于磷酸化抗体对蛋白磷酸化的检测，也不能用于碱性磷酸酶（AP）的检测。

图8. 直标间标抗体的选择

【比赛注意】

抗体的选择，即可选择直接带有酶标记的一抗，来识别靶点；又可以首选利用普通的一抗识别靶点，然后再利用带有酶标记的二抗进行识别一抗。

选择抗体需要确认一下重要信息。

1. Antigen（抗原名称/标签名称）：英文全称、简称都提供, 中文最好也提供

2. Reactivity（反应性）：实验用于什么物种, 是人, 大鼠还是小鼠等

3. Applications（应用）：抗体用于做什么实验

4.相关内参及标签抗体可参考：https://www.yeasen.com/solutiondetail/147

【委员会成员介绍】