Applications从Tn5结构来看如何利用Tn5进行文库构建

在NGS领域，tn5酶算是明星了，不管是表观建库如ATAC-seq、CUT&Tag还是在极速建库领域抑或是一步法建库技术等等的应用都颇为广泛，完全是主角的存在。那tn5酶是怎么完成建库的呢？各位看官请听小翌详说。

原始Tn5酶是由两个1.5 kb的IS50插入序列夹带的抗生素耐药区组成，IS50L和IS50R。它是通过多步骤酶切-粘贴机制行使功能。具体为：两分子tn5转座酶单体首先结合到IS50元件末端的两个19 bp区域（OE序列和IE序列），然后通过二聚体形成突触复合体；转座酶促进重组的三个核心步骤

1.这些蛋白可以识别移动元件末端的特定DNA序列，并将它们配对形成突触复合体；

2.这些蛋白在元件的每一端切割DNA，将元件的3'OH端从嵌入的DNA中解放出来；

3.这些蛋白促进新的DNA位点上的末端的两个磷酸二酯键被攻击，从而将元件的基因组连接到新的DNA片段。水在裂解阶段扮演亲核试剂的攻击角色，而元件的3 '羟基在DNA连接阶段(称为DNA链转移)扮演亲核试剂的角色[1]。

图1.Tn5转座机制[2]

Tn5发展到现在，人们已经能够利用Tn5进行体外酶切实验，也是我们现在利用Tn5酶来进行文库构建的方式。研究者发现，体外Tn5实验，只需要核心序列（ME：CTGTCTCTTATACACATCT）、Tn5转座酶以及Mg2+就能够行使Tn5 ”剪切-复制”功能。因而利用这种原理，科学家们将含测序接头序列一致的序列添加到ME序列中，在转座酶“剪切-复制”时，将ME序列插入靶DNA序列的同时，加上测序序列，从而在后续建库扩增过程中，实现一步法PCR建库就能获得完整的用于测序的文库。

图2.含不同测序引物的tn5酶应用场景[2]

当然，Tn5酶虽然有这么强的优势，但是也有一定的缺陷，就是Tn5酶在“剪切”位点末端，具有9bp的碱基偏好性。那看到这里，可能会有人问，既然有碱基偏好性，Tn5酶是不是像常用的限制性内切酶一样有识别位点呢？为什么我们一直说Tn5酶是随机切割呢？实际上，Tn5酶确实是有识别位点，但是识别位点并非像限制性内切酶一样序列特异。目前共识的Tn5/IS50目标位点为A-GNTYWRANC-T。
当然，看到这里，可以还是有人会问，那我们做像ATAC、CUT&tag这样的表观实验，如果Tn5有目标识别序列，是不是效果就不太好？这里又得说到Tn5转座的另一个特性，就是它会优先整合到主动转录或高度超卷曲的DNA区域中，这种特性就与序列特异性无关，而是与靶标的拓扑结构有关[3]。

讲了这么多的原理，那在Tn5建库过程中，含有ME序列和接头序列的包埋序列，是如果进行建库的呢？

我们以常用的含Illumina测序adapter的ME为例，来给大家详细讲解吧。

首先，隆重出场的是转座酶复合体。转座酶复合体是由两分子的Tn5转座酶加两端DNA序列，具体情况见下图：

图3.Tn5转座酶结构

转座酶复合体组合后，我们就可以进行文库构建了，Tn5转座复合体进行“剪切-复制”的过程中，会在靶DNA处产生一个9bp的gap，在文库构建的PCR阶段，需要先进行72℃的延申步骤来补平gap，具体步骤见下图：

图4.Tn5文库构建流程


大家对Tn5酶进行文库构建是否明白了呢？

[1] Rice P A , Baker T A . Rice PA, Baker TA. Comparative architecture of transposase and integrase complexes. Nat Struct Biol 8: 302-307[J]. Nature Structural Biology, 2001, 8(5):302-307.

[2] Li N , Jin K , Bai Y , et al. Tn5 Transposase Applied in Genomics Research[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(21):8329.

[3]Goryshin, Igor Y , Miller, et al. Tn5/IS50 target recognition.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1998.