ApplicationsRNA提取知识锦囊

RNA提取是分子生物学实验的基础核心操作，对于基于 RNA 的许多分子实验（例如，RT-qPCR 、Northern 印迹分析以及 cDNA 文库构建）而言，获得高质量 RNA 是开展这些技术的第一步，也是很关键的一步。

一、RNA提取核心基础认知

1. 提取核心原则

• 防降解：RNase（RNA酶）是RNA的“天敌”，耐高温、耐酸碱，常规高压灭菌无法完全灭活，因此，需要做好防控和抑制措施，① 防控措施，从“人机料法环”入手做全面的防控。实验室最好设置专门的 RNA 操作区，操作台、离心机、移液枪、试剂等均应专用，定期消毒和清洁，清洁可以使用固相RNase清除剂。使用无 RNase 的枪头（无菌盒装滤芯吸头系列）、EP 管（离心管灭菌系列）、试剂、无核酸酶水和DEPC 水。手汗、唾液等都存在大量的 RNase，所以要注意穿长袖实验服和长裤，带口罩操作。② 抑制RNA酶起酶解作用的措施很简单，常温环境都是RNA酶的温床，所以要快速+低温（一般都是液氮），新鲜样本从取下来的时候就已经开始酶解了，我们要以最快的速度速冻并且研磨，后续的步骤就不需要液氮了（一般会有试剂的保护）。
• 保完整：RNA是单链，没有中间的氢键，空间结构简单，稳定性差，也容易造成突变和断裂，所以要避免剧烈震荡、反复冻融、高温，实操中需温和操作、全程低温（4℃或冰浴）。
• 提纯度：去除样品中的蛋白质、DNA、多糖、脂类等杂质，避免杂质干扰下游实验（如DNA污染会影响qPCR结果，蛋白质污染会抑制反转录酶活性）。

2. 常见RNA类型及提取重点

细胞/组织中RNA主要包括mRNA（占1%-5%）、rRNA（占80%-85%）、tRNA（占10%-15%），不同RNA类型以及不同样品提取重点不同，以下是几种常见的样本类型的提取重点：

• 动物细胞/组织：细胞破碎容易，重点在于快速裂解、彻底去除蛋白质，避免RNase污染。
• 植物组织：含有细胞壁、多糖、多酚等杂质，需先去除细胞壁（研磨+裂解液），额外增加去多糖、多酚步骤，防止杂质与RNA结合。
• 细菌/真菌：需先破除细胞壁（溶菌酶处理、玻璃珠震荡），再进行裂解，避免菌体残留导致的杂质污染。
• 血液样品：红细胞无细胞核，RNA主要来自白细胞，需先离心去除红细胞，再裂解白细胞，防止血红蛋白干扰提取。

二、RNA提取方法

三、实操关键技巧（避坑重点）

1. 器材与环境处理技巧

• 离心管、枪头：直接使用无RNase专用款，无需额外处理；若使用普通款，可以用0.1% DEPC水浸泡过夜，121℃高压灭菌20min，烘干后使用（DEPC高温分解，无残留毒性）。
• 实验台面、离心管架：用75%乙醇擦拭消毒，再用DEPC水擦拭，避免环境中的RNase污染。
• 操作禁忌：全程佩戴一次性无粉手套和口罩；禁止用手触碰离心管内壁、枪头尖端；实验过程中避免说话、打喷嚏，防止唾液中的RNase污染样品。

2. 样品处理关键技巧

• 新鲜样品优先：RNA提取的最佳样品是新鲜取样的组织/细胞，若无法立即提取，需液氮速冻后-80℃保存，保存时间不宜超过1个月（植物样品可保存3个月）。
• 裂解充分：样品裂解不充分会导致RNA提取不完全，可延长室温静置时间、温和吹打，植物样品可增加研磨时间，细菌样品可提前用溶菌酶处理。
• 避免DNA污染：若下游实验对DNA污染敏感（如qPCR、RNA-seq），可在RNA溶解后，加入DNase I（无RNase），37℃孵育30min，去除残留DNA，再用氯仿-异戊醇洗涤、乙醇沉淀，纯化RNA。

四、RNA质量检测方法

1. Nanodrop检测（快速检测浓度与纯度）

1. 浓度：通过A260吸光度检测。
2. 纯度：A260/A280比值为1.8-2.0，说明RNA纯度良好；A260/A230比值>2.0，说明无盐离子、多糖等杂质污染。

2. 琼脂糖凝胶电泳检测（检测完整性）

• 电泳条件：1%琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120V电泳20-30min。
• 合格标准：动物RNA可见两条清晰条带（28S rRNA和18S rRNA），且28S条带亮度约为18S的2倍；植物RNA可见三条条带（28S、18S、5S rRNA），条带清晰、无弥散，说明RNA完整无降解；若条带弥散、无清晰条带，说明RNA已降解。

3. qPCR验证（间接检测质量）

以提取的RNA为模板，进行反转录和qPCR，若Ct值正常、溶解曲线单一，说明RNA质量良好，可用于下游实验。

五、注意事项与安全提示

• 安全操作：涉及到有毒、易挥发的DEPC、氯仿、异丙醇等试剂，操作时需在通风橱中进行，佩戴手套、口罩、护目镜，避免接触皮肤和呼吸道。实验废弃物按有害废弃物处理。
• 下游实验衔接：提取的RNA需尽快用于下游实验，若长期保存，需分装后于-80℃存放，避免反复冻融。

六、RNA提取相关产品选品指南