Case StudiesRaw264.7诱导破骨细胞实验方案

一、破骨细胞前体细胞接种

1. 将生长状态良好的Raw 264.7细胞用含10%胎牛血清（40132ES）的α-MEM完全培养基重悬，并进行细胞计数。

2. 将细胞以2.5×10³cells/mL的密度，接种于已预先放置无菌盖玻片的24孔细胞培养板中，每孔加入1 mL细胞悬液。

3. 将培养板置于37°C、5% CO2的细胞培养箱中静置培养18小时，使细胞充分贴壁。

二、破骨细胞诱导分化

1. 细胞贴壁后（接种后约18小时），吸弃孔内旧培养基。

2. 更换为新鲜的破骨细胞诱导完全培养基。诱导培养基为含10% FBS的α-MEM培养基，并补充50 ng/mL重组小鼠M-CSF蛋白(91114ES)及100 ng/mL重组小鼠RANK L蛋白(95625ES)。

3. 此后，每3天更换一次诱导培养基。更换时，轻柔吸弃旧液，并加入等体积的、含有相同浓度M-CSF蛋白与RANK L蛋白的新鲜诱导培养基。

三、细胞形态学观察与鉴定

1.形态观察：自诱导开始，定期在倒置显微镜下观察细胞形态变化。通常，在RANK L诱导4天后，可观察到典型的多核破骨细胞样结构。

2.TRAP染色验证：RANK L诱导5天后，进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色以特异性鉴定破骨细胞。严格按照TRAP染色试剂盒的说明书步骤进行染色操作。

3.染色完成后，在光学显微镜下观察。成熟的破骨细胞胞浆呈红色或红紫色。

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重组小鼠RANKL:是驱动破骨细胞终末分化与融合的决定性信号，激活下游NFATc1等关键转录程序

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