应用方向破骨细胞培养高成功率的关键——高活性RANKL和M-CSF

取6-17周龄小鼠，使用CO2吸入或颈椎脱臼致死。用70%酒精消毒小鼠毛皮。

小心地取出股骨和胫骨，并将其放入10厘米的培养皿中。

无菌条件下准备股骨和胫骨：

获得的细胞悬液300×g，4°C下离心7min，弃上清。

用5ml红细胞裂解液重悬细胞。冰上裂解10min。

离心，弃上清。再用5ml含10%FBS的 α-MEM培养基重悬，离心，弃上清。

用5ml含M-CSF (25 ng/ml）和10%FBS的 α-MEM培养基重悬细胞。接种于6孔细胞培养板中（每只小鼠一孔），置于37°C、5%CO2细胞培养箱中过夜（14至18小时）。

第二天，吸取培养基，收集未粘附的细胞，注意勿刮擦平板底部。将培养基转移至50ml锥形离心管中。300×g，4℃，离心7min，弃上清。

用5ml含10%FBS的 α-MEM培养基重悬细胞，并使用细胞计数装置计数活细胞。

以1×106cells/ml密度接种于培养板上，并加入M-CSF（50ng/ml）和RANKL（25–100 ng/ml）。

3天后更换培养基。第五天左右一般能观察到多核成熟破骨细胞。

TRAP染色鉴定破骨细胞。