技术讲解纯干货！qPCR绝对定量操作解析

Q1：绝对定量是什么？

绝对定量（Absolute Quantification）是指通过已知拷贝数的标准品构建标准曲线，根据未知样品的Ct值计算出其精确的起始模板拷贝数或浓度。

Q2：绝对定量和相对定量的区别

绝对定量的核心：标准品制备

标准品是绝对定量的基石，标准品的质量直接决定最终结果的准确性。质粒DNA因其纯度高、稳定、易大量制备的优点，成为最常用的绝度定量

标准品。

质粒标准品制备流程（最常用方法）

目的片段扩增：设计引物扩增含目标序列的片段（建议比qPCR扩增片段长100bp左右）

TA克隆：将PCR产物连接至T载体

转化扩增：转化大肠杆菌，提取质粒

线性化处理：超螺旋质粒的扩增效率与基因组DNA不同，建议用限制性内切酶线性化（在插入片段上游或下游酶切）

纯化定量：推荐使用荧光染料法（如Qubit）准确定量，比OD260更准

拷贝数计算：copies/μL = (浓度 g/μL × 6.02×10²³) / (质粒长度 bp × 660)

示例计算：

测得质粒浓度 = 100 ng/μL = 1×10⁻⁷ g/μL

质粒长度 = 3000 bp

分子量 = 3000 bp × 660 g/mol/bp = 1.98×10⁶ g/mol

摩尔数 = 1×10⁻⁷ g/μL / 1.98×10⁶ g/mol = 5.05×10⁻¹⁴ mol/μL

拷贝数 = 5.05×10⁻¹⁴ × 6.02×10²³ = 3.04×10¹⁰ copies/μL

标准品梯度稀释

计算初始拷贝数浓度后，用稀释缓冲液（含载体RNA或DNA的TE缓冲液可防止低浓度吸附）进行10倍梯度稀释

至少制备5个浓度点，覆盖未知样本可能的范围

推荐梯度：10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴ copies/μL（示例）

关键操作：涡旋震荡充分混匀，每次换新吸头，避免交叉污染

实验设计要点

加样布局示例（96孔板）

Std：标准品；S：未知样本；NTC：无模板对照

qPCR上机运行

数据分析

示例数据

线性回归方程：Ct = -3.3 × log₁₀(拷贝数) + 41

关键质控指标

扩增效率计算示例：

斜率 = -3.48

E = 10^(-1/-3.48) - 1 = 10^(0.287) - 1 = 1.94 - 1 =0.94（94%）

未知样本浓度计算

示例：未知样本Ct = 23.0

代入标准曲线方程：

23.0 = -3.3 × log₁₀(拷贝数) + 41-3.3 × log₁₀(拷贝数) = 23.0 - 41 = -18log₁₀(拷贝数) = 18 / 3.3 = 5.45拷贝数 = 10^5.45 ≈ 2.8×10⁵ copies/反应

换算为原始样本浓度：

若加入反应模板体积 = 2 μL

原始样本浓度 = 2.8×10⁵ / 2 = 1.4×10⁵ copies/μL

相关产品推荐