LiteraturePlant Cell|CUT&Tag联合RNA-seq测序，解析大豆根瘤衰老的调控机制

2023年5月13日，华中农业大学曹扬荣教授团队与东北农业大学陈庆山教授合作在The Plant Cell上在线发表了题为“GmNAC039 and GmNAC018 activate the expression of cysteine protease genes to promote soybean nodule senescence”的研究论文，该文章利用CUT&Tag技术联合RNA-seq，解析了大豆根瘤衰老的分子调控机制。该研究同时被期刊编辑选为亮点工作进行了评论（Doll, 2023）。

文章中CUT&Tag-qPCR实验使用翌圣CUT&Tag试剂盒（Cat#12598）完成。文章见刊后，不少客户咨询植物细胞核处理步骤，在此，小翌借花献佛列出该文章提核的操作步骤，期望能帮助更多植物客户解决样本预处理问题。

植物提核步骤

大豆根瘤通常含有大量的共生根瘤菌，在实验时，容易造成细菌污染，本文作者开创性的在CUT&Tag实验时，制备大豆根瘤细胞核悬液时，将细菌及一些杂质等去除，保持CUT&Tag实验时细胞核悬液的纯净，具体步骤为：

1、称取0.1 g新鲜根瘤，在培养皿中用刀片切碎成肉泥状（切之前需加入少量含蛋白酶抑制剂的PBS，刚浸没根瘤即可）；
2、加入1 mL含PIC的PBS重悬切碎后的根瘤，吹打均匀；
3、用两层滤布过滤步骤2中溶液以去除大的杂质；
4、用5 μm的PEP膜过滤以去除根瘤菌；
5、使用1 mL的PBS冲洗PEP膜两次，以去除残留的根瘤菌；
6、使用1 mL的PBS漂洗PEP膜，收集根瘤核；
7、1000 g 4℃ 离心10 min；
8、去上清，沉淀用预冷的500 μL核提取buffer（20 mM HEPES buffer (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidine, and protease inhibitor）重悬；
9、1000 g 4℃ 离心10 min；
10、去上清，沉淀用预冷的500 μL核提取buffer（20 mM HEPES buffer (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidine, and protease inhibitor）重悬；
11、1000 g 4℃ 离心10 min；
12、去上清，沉淀用预冷的100 μL核提取buffer（20 mM HEPES buffer (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidine, and protease inhibitor）重悬；
取10 μL用DAPI染色镜检和计数。

Spikein校正后，更能反映数据的真实性

图：常规normalization，不同投入量结果一致,不能体现样本的差异，利用spike in normalization后，真实展现样本间的差异。

不同投入量细胞,spike in校正后,基因的富集倍率不受起始细胞投入量影响，定量更准确;低富集基因,spikein校正后，富集更明显。