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应用案例pCMV质粒 | 100mL菌液质粒大提案例

📂 核酸提取与纯化类型 ID 5002

👁 8,212 次浏览 🗓 2026-10-09 源站内容 ID：2012067714429669376

实验所用试剂清单试剂无水乙醇异丙醇19037ES无内毒素质粒大量提取试剂盒V260401ES动态浊度法内毒素检测鲎试剂耗材50 mL离心管2 mL细心管50 mL离心管架设备Thermo角转子离心机移液器琼脂糖凝胶电泳设备Nanodrop操作步骤01菌体收集、裂解与澄清1.菌体收集：通过多次离心收集所需要的菌体量。取100 mL菌液分装到2个50 mL离心

来源：翌圣生物｜原文：https://www.yeasen.com/solutiondetail/2012067714429669376 ↗

实验所用试剂清单

试剂	无水乙醇	异丙醇	19037ES无内毒素质粒大量提取试剂盒V2	60401ES动态浊度法内毒素检测鲎试剂
耗材	50 mL离心管	2 mL细心管	50 mL离心管架
设备	Thermo角转子离心机	移液器	琼脂糖凝胶电泳设备	Nanodrop

操作步骤

菌体收集、裂解与澄清

1.菌体收集：通过多次离心收集所需要的菌体量。

取100 mL菌液分装到2个50 mL离心管中（共3个样本，6管），6000×g离心3 min，弃上清。

2. 重悬菌体：加入10 mL溶液SI，振荡至无可见菌块。

3. 裂解处理：加入10 mL溶液SII，轻柔翻转混匀4~10次，形成透明裂解液（裂解时间4 min）。

4. 中和并澄清沉淀：加入8 mL溶液SIII，100 µL RNase A，翻转混匀10次，室温静置10 min，10000×g离心5 min。

5.使用推杆过滤器将上清液过滤至50 mL尖底离心管（得约25mL上清），加10 mL 结合液PB混匀备用。

质粒纯化

6.吸附柱平衡：（建议在处理上清液期间处理）向吸附柱E2加4 mL平衡液BS，静置2 min，6000×g离心2 min，弃废液。
7. 吸附柱吸附质粒：步骤5所得混合液，通过多次离心，将样品吸附到吸附柱E2柱中。混合液用量9 mL/次，分4次离心，6000×g离心2 min。。
8. 漂洗：加入8 mL溶液W1漂洗一次，8 mL漂洗液WS（漂洗两次），每次6000×g离心2 min（
9. 干燥：10000×g空离5 min，并室温放5 min彻底去除乙醇。

质粒洗脱

10. 加入1.2 mL洗脱缓冲液EB，室温静置5 min，10000×g离心3 min收集洗脱液。

细节注意

1.结合液的比列一定要准确，不能加少，可以略多加；

2.菌体一定要打散，如果成块裂解不完全，会影响质粒得率；

3.加入无水乙醇和异丙醇之后，一定要剧烈晃均匀。

质检结果

样本	浓度（nanodrop）	A260/A280	A260/A230	内毒素残留
1	1165.675	1.89	2.2	≤1 EU/μg
2	1417.042	1.94	2.35	≤1 EU/μg
3	1435.989	1.93	2.1	≤1 EU/μg

实验结论

3个pCMV质粒样本，100mL菌液提取质粒，试剂盒采用翌圣生物 19037ES无内毒素质粒大量提取试剂盒V2，质粒的产量、纯度、内毒素残留满足需求，无RNA残留，超螺旋比列高，整体结果符合下一步转染实验的质控标准。

数据来源：上海某CRO企业

来源与原文

来源： 翌圣生物

原文链接： https://www.yeasen.com/solutiondetail/2012067714429669376

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