前沿资讯翌圣Hieff Taq DNA ligase助力高效无缝克隆

无缝克隆因具有不受酶切位点限制、可以在质粒的任何位点进行一个或多个DNA片段插入的特点而备受科学家们青睐。Taq DNAligase作为无缝克隆的关键酶之一，在其中发挥了不可替代的作用。

Taq DNA ligase来源于嗜热菌Thermus thermophilus HB8，是一种耐高温连接酶，以NAD⁺为辅酶因子，在45℃-65℃范围内均有活性。能催化与同一互补靶DNA链杂交的两条相邻寡核苷酸链的5´-磷酸和3´-羟基之间形成磷酸二酯键。该催化反应只有当两条寡核苷酸链与互补靶DNA完全配对，且两条寡核苷酸链之间没有间隙的条件下才会发生。

1.无缝克隆^[1]

2.SNP基因分型检测^[2]

3.全基因合成扩增^[3]

4.NGS建库中nick连接

无缝克隆依赖于dsDNA的黏性末端进行互补配对，与传统克隆不同的是无缝克隆采用外切酶来产生粘性末端。T5核酸外切酶能够沿着5’→3’方向，降解dsDNA，从而产生黏性末端。但T5外切酶并不能保证每一个片段5’端都会酶切成一样长的粘性末端，退火之后可能会产生缺失的碱基。因此退火之后，无缝克隆中的DNA聚合酶会针对缺失的碱基进行添加，Taq DNA ligase催化碱基之间形成磷酸二酯键，将所有缺口补齐。

图1. 无缝克隆原理图

翌圣Hieff^®Taq DNA ligase在野生型的基础上进行定向改造，具有更高的连接效率，应用于无缝克隆性能较野生型得到显著提高。

使用翌圣及竞品N*的Taq DNA ligase进行无缝克隆，结果如图2所示，翌圣Hieff^®Taq DNA ligase具有更高的阳性克隆率。

图2. 翌圣及N* Taq DNA ligase无缝克隆电泳检测结果

琼脂糖凝胶电泳检测Hieff^® Taq DNA ligase无切口酶、外切酶及RNase残留。

图3. 切口酶、外切酶及RNase残留检测结果

1. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA 3rd, Smith HO. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 2009;6(5):343-345. doi:10.1038/nmeth.1318

2. Li Y, Wark AW, Lee HJ, Corn RM. Single-nucleotide polymorphism genotyping by nanoparticle-enhanced surface plasmon resonance imaging measurements of surface ligation reactions. Anal Chem. 2006;78(9):3158-3164. doi:10.1021/ac0600151

3. Bang D, Church GM. Gene synthesis by circular assembly amplification. Nat Methods. 2008;5(1):37-39. doi:10.1038/nmeth1136