Case StudiesHiActi细胞因子 | 小鼠胃类器官培养案例
小鼠胃类器官的培养核心是“模拟体内胃组织发育微环境+利用胃上皮干细胞的自我更新与定向分化潜能”，通过体外重构关键信号通路、细胞外基质和营养条件，让胃源性干细胞（或组织片段）自发组装形成具有胃组织特异性结构和功能的三维器官样结构，本质是对体内胃上皮再生与稳态维持机制的体外复刻。01小鼠胃类器官培养步骤实验前准备培养基配制：基础培养基选用DMEM/F12（414
小鼠胃类器官的培养核心是“模拟体内胃组织发育微环境+利用胃上皮干细胞的自我更新与定向分化潜能”，通过体外重构关键信号通路、细胞外基质和营养条件，让胃源性干细胞（或组织片段）自发组装形成具有胃组织特异性结构和功能的三维器官样结构，本质是对体内胃上皮再生与稳态维持机制的体外复刻。
小鼠胃类器官培养步骤
实验前准备
培养基配制：基础培养基选用DMEM/F12（41420ES），再添加核心生长因子与添加物，包括50 ng/mL EGF（92703ES）、100 ng/mL Noggin（92291ES）、100 ng/mL FGF-10（91319ES）、50% Wnt条件培养基、10% R-spondin（92295ES）等，初始培养4天还需加入10 nM Y-27632（53006ES）以减少细胞凋亡。另外补充10 nM胃泌素（53007ES）、谷氨酰胺（60314ES）、B27添加剂（60703ES）等，同时加入青/链霉素（60162ES）抑制污染。
材料与仪器：手术剪镊、24孔培养板（84013ES）、70 μm细胞滤网（84702ES）、离心机（80163ES）等；提前准备预冷的PBS（60158ES）、基质胶（Ceturegel）（40192ES）、胎牛血清（FBS）（40130ES）、红细胞裂解液（40401ES）等，基质胶需全程冰上操作防止提前凝固。
原代培养
组织取材与预处理：将小鼠处死后浸泡在75%乙醇中消毒，在超净台内剖开腹腔取出胃，置于预冷且含双抗（Pen-Strep）的PBS中。剪开胃部冲洗内部杂质，剥离外层脂肪、筋膜，刮去表面浆膜肌，再将胃组织剪碎成2-5 mm²的碎片。
组织消化与细胞分离：把组织碎片放入离心管，加入10 mL 10 mM EDTA（60163ES）室温消化10分钟，期间每隔2分钟颠倒混匀；弃去EDTA后，可用含胶原酶的消化液（41423ES）进一步消化，或用玻璃片挤压组织挤出腺体。随后加入2-5%终浓度的FBS终止消化，吹打混匀后过70 μm滤网，收集滤液1000 rpm离心5分钟。若有红细胞沉淀，加红细胞裂解液处理3分钟，再用PBS重悬离心弃上清。
基质胶包埋与接种：用少量基础培养基重悬细胞沉淀，将细胞与基质胶按合适比例混合，每孔以25-30 μL的量接种到24孔板。把培养板放入37℃培养箱20-30分钟使基质胶凝固，之后加入预热的完全培养基浸没胶块。
初期培养：置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，理想状态下2-4小时内腺体结构会变圆且边界清晰，每3-4天更换一次培养基，避免触碰基质胶，培养3-5天可见初步的类器官结构。
传代培养
通常每12天左右传代一次。先吸去培养基，加4℃ PBS浸泡2分钟，轻柔吹打基质胶收集类器官悬液，1000 rpm离心5分钟弃上清。可用26G针头破碎类器官，或直接重悬于新的基质胶中，按原接种方式铺板固化，再添加新鲜完全培养基继续培养。
冻存与复苏
冻存：收集基质胶中的类器官，离心后弃上清，加入适量类器官冻存液轻柔重悬。一般2-3孔的类器官冻存为1管，做好标记后程序降温，最后移入液氮长期保存。
复苏：从液氮中取出冻存管（84105ES），迅速放入37℃水浴锅1-2分钟内快速融解。将融解后的类器官转移至含10 mL DMEM/F12的离心管，1000 rpm离心5分钟，弃上清后用基质胶包埋接种，添加完全培养基培养。
小鼠胃类器官培养结果
用光学显微镜观察小鼠胃类器官培养情况：
数据来源：Yeasen实验室
结果显示：小鼠胃类器官具有明显的立体感，边界（即最外层的上皮细胞）非常清晰、光滑、明亮，形成一个封闭的腔状结构。
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名称 | 货号 | 推荐浓度 |
Recombinant Mouse EGF Protein 重组小鼠表皮生长因子 | 50 ng/mL | |
Recombinant Mouse R spondin 1/RSPO1 Protein, His Tag（HEK293) 重组小鼠RSPO1蛋白 | 500 ng/mL | |
Recombinant Mouse Noggin Protein (HEK293) 重组小鼠Noggin蛋白 | 100 ng/mL | |
Recombinant Mouse KGF-2/FGF-10 重组小鼠KGF-2/FGF-10 | 100 ng/mL | |
Recombinant Human Wnt-3a protein 重组人Wnt3a蛋白（液体） | 100 ng/mL | |
其他产品
类别 | 产品名称 | 货号 |
抗体 | LGR5 Mouse mAb | |
E-cadherin Mouse mAb | ||
MUC5AC Goat pAb | ||
CD44 Mouse mAb | ||
EpCAM Rabbit mAb | ||
Chromogranin A Mouse mAb | ||
Gastrin Mouse mAb | ||
Ki67 Rat mAb | ||
CD31 Mouse mAb | ||
基质胶 | Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free基质胶 | |
小分子化合物 | Y-27632 | |
NAC | ||
CHIR99021 | ||
Retinoic acid | ||
A83-01 | ||
LDN193189 | ||
Nicotinamide | ||
SB431542 | ||
L-Glutamine |
参考文献：
1. Noguchi TK, Kurisaki A. Formation of Stomach Tissue by Organoid Culture Using Mouse Embryonic Stem Cells. Methods in molecular biology (Clifton, NJ) 2017; 1597:217-228.
2. Schumacher MA, Aihara E, Feng R, Engevik A, Shroyer NF, Ottemann KM, et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. The Journal of physiology 2015; 593(8):1809-1827.
3. Murakami K, Terakado Y, Saito K, Jomen Y, Takeda H, Oshima M, et al. A genome-scale CRISPR screen reveals factors regulating Wnt-dependent renewal of mouse gastric epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2021; 118(4).
4. Pang MJ, Burclaff JR, Jin R, Adkins-Threats M, Osaki LH, Han Y, et al. Gastric Organoids: Progress and Remaining Challenges. Cellular and molecular gastroenterology and hepatology 2022; 13(1):19-33.
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培养用细胞因子 | |
类器官培养案例 |
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多能干细胞 胚胎干细胞 诱导多能干细胞 | |
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类别 | 解决方案 |
先天性免疫细胞 吞噬细胞 树突状细胞 自然杀伤细胞 嗜酸/碱性粒细胞 | 小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDC）培养方法及细胞因子的选择 |
适应性免疫细胞 T细胞 B细胞 |
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