比例根据具体实验情况进行调整。建议做预实验:如海参载体与萤火虫载体比例分别用 1:10、1:20、1:50、1:100。
报告基因FAQ
同一个孔里检测。不会相互影响,海肾荧光素酶底物中有淬灭萤火虫荧光值的物质。可以分开检测,但通常是在一个孔里进行检测。
不同检测仪器的灵敏度和参数设置不同,会出现相同样本的本底值检测有差异的情况。
白色不透明的酶标板。
10ml PBS里加入0.3ml Triton X-100,配置成3% Triton X-100。
可对细胞裂解样本进行5倍稀释后再检测。
1、荧光素酶是表达在细胞内,是一种不存在于人类物种的水解酶(所以本底很低),它不能透膜。荧光素酶的底物是环状小分子,是疏水的,因而可以透膜的,因此只要存在荧光素酶表达,那必然是外源的,那么将底物加到细胞培养基中或打到体内均能得到信号。2、报告基因体外检测需要细胞裂解是为了避免细胞转染异质性、底物渗透…
不可以调整。在该检测试剂盒中,其中组分B萤火虫萤光素酶缓冲液无论对于萤火虫荧光素酶还是海肾荧光素酶的检测都至关重要,海肾萤光素酶的最适反应环境需要有组分B的存在,否则会出现海肾荧光素酶检测值非常低的情况。当仅需要检测海肾荧光素酶时,也需要加入组分B,这样才能保证最适反应环境检测到正确的结果。
不能。 需要带生物化学发光模块的仪器, 全波长 350-700 nm 检测。 如GloMaxTM20/20(单管检测),Biotex HTX 多功能酶标仪(配备自动进样器)。
可保存在-80℃,与蛋白的保存方法类似。裂解后的样本可在 -80 ℃保存半年, -20 ℃保存一个月。
将裂解的样品进行稀释。
如果是对同一细胞系做快速药物筛选,通常选择单报告基因检测试剂即可;如果是做启动子结构功能分析、转录调控机制研究、miRNA 靶基因验证等通常需要选择双报告基因进行检测。
这两个底物操作过程中不需要严格避光。保存的时候避光保存,更重要的保存条件是低温, 尤其是海肾检测试剂的底物腔肠素,推荐-80℃保存。
比例:根据具体实验情况进行调整。建议做预实验:如萤火虫载体与海参载体比例分别用 1:10、1:20、1:50、1:100。
通常萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)作为主报告基因,海肾萤光素酶( Renilla luciferase )作为内参报告基因。
可以检测烟草叶片样本。因这款试剂盒本身没有单独的裂解液,对于植物样本检测之前,需要自行对样本进行裂解处理。
可以与海肾质粒共转染,有海肾质粒卖,常卖 pGMLR-TK Luciferase Reporter Plasmid(pGMLR-TK 海肾荧光素酶报告基因质粒),11557ES03。
首先需要确认检测试剂盒的检测性能,另外确认质粒测序的正确性,以及本身信号通路的激活。
首先需要确认检测试剂盒的检测性能,另外确认质粒测序的正确性,以及本身信号通路的激活
离心是选做的。以HEK293T为例,按照说明书加入相应的裂解液可以完全裂解,这种情况下不需要离心,当肉眼可见残留的细胞碎片时建议进行离心。