细胞培养FAQ

4℃孵育的时间放可以延长，吸附的病毒量可以增大，不过同时也会增加吸附杂质的比率，孵育时间可以参考说明书的建议范围。

一直摇晃混匀会影响吸附效果，这个过程需要静置吸附的时间。

成分PEG，可提高100倍病毒滴度。至于沉淀有没有，要根据客户原始的病毒的总量。

无法去除杂蛋白，该试剂盒属于生物吸附-PEG浓缩，原理是聚合物沉淀法。

含有聚乙二醇，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离，使病毒聚合在一起，提高病毒的相对浓度，达到沉淀浓缩的目的。

慢病毒属于逆转录病毒科，其他逆转病毒也可以。

虽然它属于逆转录病毒，但是病毒的整个大类其实很多，不能改成通用病毒浓缩液。

白色沉淀的多少并不代表病毒量的多少。白色沉淀中除病毒颗粒外，还有血清蛋白和少量的细胞碎片和基因组DNA等。去除方法，重悬病毒后，4℃ 12,000×g离心3-5min，吸取上清即为浓缩的病毒。

含有该载体；稳转筛选所用为Puromycin，G418；后期分选为荧光筛选；只需要客户另外准备目的质粒。

慢病毒包装，一般用三质粒或者四质粒系统，分别构建病毒的不同组件，我们的慢病毒包装试剂盒，提供阳性对照的质粒，但是：(1)质粒序列都不提供；(2)质粒的酶切位点不能提供。

①质粒构建有问题，如果不是同一个质粒，可以质粒测序确定质粒是否正确，是否有移码或者脱靶问题； ②如果质粒没问题，可能是慢病毒载体不正确导致病毒包装不成功，我们试剂盒是兼容二代，三代的慢病毒载体； ③如果以上两种都没问题，可能是感染的细胞是悬浮细胞或者是贴壁不牢的细胞，可以使用聚凝胺增加病毒感染率或者…

不建议用了，转染试剂是脂质体的，不能冰冻。

胶原酶不会受到培养细胞所用的血清影响。

胶原酶的抑制剂有 EDTA 、EGTA 等；二是重金属离子（Hg2+,Pb2+,Cd2+）；还有一些化学试剂如 Cysteine、 histidine、DTT、2-mercaptoethanol、o-phenanthroline 等，这些对胶原酶有抑制作用。

建议在 Hank’s，Earle’s 或者其他平衡盐溶液中溶解，推荐使用工作浓度 0.05 % ~0.5 % (w/v)。

(1)如果是酶活不强或钙离子不足导致，应在低温干燥条件下储存胶原酶，胶原酶溶液分装后冻存(2)如果是钙离子不足导致，应将胶原酶溶液中钙离子浓度设置为 5mM。

（1）如果是蛋白酶过量，应减少蛋白酶接触时间或是加入白蛋白或灭活血清（2）如果是 pH 改变应使用缓冲液（如 HBSS）；经常检查并重新调节 pH（3）如果氧气太少，应给消化液通无菌空气

如果是蛋白酶过多导致，应减少蛋白酶用量或是加入白蛋白或灭活血清。

对于组织解离，常使用粗制胶原酶制剂，例如弹性蛋白酶，胰蛋白酶或木瓜蛋白酶等；对于胶原蛋白结构和生物合成研究，常使用更高纯度的胶原酶制剂，不含其他蛋白水解活性。

会影响细胞表面抗原，可以选择对抗原影响较小的胶原酶Ⅳ。不同类型的肿瘤对应合适的酶，后续做流式，不同的消化强度对于细胞表面抗原也是存在影响的。