可以在插入位点下游选择限制酶切割，切割产生平末端或 5-突出端最好。
体外转录FAQ
37℃和 42℃转录能力无差别，但是不耐 50℃。
模板线性化不完全，导致转录停不下来，所以转录条带会偏大，出现杂带。
我们的T7酶测试了相对保真度，与Thermo的保真度差不多，大概万分之四的突变率。目前野生型的T7保真度都差不多，基本能满足客户的需求。现项目中没有更高保真度T7的开发计划。
是通过LiCl纯化后进行测定的，我们有记录过相关数据A260/280大概比值再在2.0-2.1之间；使用我们的羧基磁珠纯化也基本在这个范围以内。具体数据可以整理之后再分享。
这一情况是T7反应体系的自身特性，无法完全避免。根据相关的文献，控制mRNA自延长的思路主要还是两方面：①对模板3'末端上游序列进行优化；②控制IVT产量，高产量下自我延伸的几率会更高。
无核酸外切酶、切口酶、Rnase 残留残留。
体外转录后长度：1142bp；质粒模板本身长度~3700bp。
polyA 尾是设计模板时引入，加帽是单独加。
①提高NTP，帽类似物的投入量比例；②添加剂的合理应用；③反应温度可以用到40度。IVT体系优化可以从模板，T7酶的使用量，如果是共转录加帽可以考虑帽子与NTP之间的比例；酶法加帽的话，在加帽酶，2-O-甲基转移酶以及SAM的用量配比上进行条件优化。关于模板除了线性化要完全这一块，还有一点就是序列设…
20uL体系等比放大到10mL应该得率差不多的，我们一般从20uL直接放大到50mL，得率基本也在100ug/20uL的水平；我们50mL也会用离心管和金属浴的方式来测，10mL正常来说应该放大效果更好；这种情况下，一般建议酶和NTP的终浓度微调一下再试试。
就我们的其他客户返样，我们用Qsep100测的CE结果来看，比较理想的状况CE完整度能到88~92％；当然做到这个水平通常也需要经过一系列的优化；一般产量是在120-220ug/ul（产量与序列设计有很大关系），共转录方式，mRNA产量有8g/L，做工艺优化产量会提升，目前市面上的工艺质量参数，有的…
RNA电泳我们也会做，主要是简要的看一下产物纯度，是否有明显的聚体这些；如果是看RNA大小，电泳的时候一般会点一个明确大小的RNA样，作为参考。
对模板的检测目前能找到的主要是序列完整性还有内毒素、宿主核酸残留这些检项，RNase还没有明确找到对应的检测建议方法；或者也可以参考我们酶产品中RNase残留的检测方法，相对还是比较简单可靠的。
IVT过程中的ds生成有多种可能的原因，主要有：①T7 pol会以产物RNA作为模板，在其3'末端继续延伸RNA，延长序列与原RNA分子3'末端序列互补配对，形成发卡结构；②T7 pol可以把RNA当作模板来复制RNA分子，合成与其互补的另外一条链；（除去dsRNA目前是没有很好的方式，有专利报导用…
关于优化IVT体系与反应条件抑制dsRNA的建议主要还是以下几点：①降低镁离子浓度；但降低镁离子浓度也会导致RNA合成产量的降低，需要去一个平衡点；②提高IVT反应温度，50-56℃的反应温度能有效降低产物中dsRNA的含量；但是高温反应对工艺放大设备的要求会不一样，也可能提高成本；③IVT反应体系…
内部有研究过这个沉淀，是镁离子、RNA、钠离子和焦磷酸镁的聚合物，且有个凝聚作用，聚团会不断变大（类似的胶状、絮状、颗粒沉淀都是类似原理）， 加水和加EDTA的效果类似也佐证了这个说法。原因：1.Mg离子浓度过高会和焦磷酸聚集形成焦磷酸镁沉淀，但是具有聚合作用，不断地包裹核酸形成胶状物导致产量下降。…
可以考虑WAVE、海道夫反应釜、赛多利斯，主要还是需要找到和现有IVT体系适配的袋子；对于搅拌罐体，螺旋桨的转速也需要根据实际情况优化，跟桨叶类型和大小有关系，建议可以向设备生产厂家咨询。
工业上酶法加帽最常使用的是牛痘病毒加帽酶处理IVT产物可以将其修饰成Cap 0 mRNA，Cap 0结构可以在二氧甲基转移酶（2'O-methyltransferase）的作用下进一步修饰成Cap 1（m7GpppmN）。利用酶法加帽，加帽效率可以达到95%以上。共转录加帽法操作简便，但由于GTP会…
建议整个反应时间在2-3小时之间，我司验证最长3h反应，合作客户有验证4h 反应结果正常。