① 提升复杂模板的扩增能力：增强了对高 GC 含量、回文结构等复杂模板的延伸能力，使 NGS 测序覆盖度更加均一，降低所需测序深度，同时减少测序中的 Gap 区域，提高单细胞测序的数据质量与完整度。② 提高扩增产物产量与效率：在全基因组扩增（WGA）、多重置换扩增（MDA）及滚环扩增（RCA）等实验…
工具酶FAQ
UniPhi29适用于所有需要phi29 DNA聚合酶链置换活性和持续合成能力的等温扩增实验，包括但不限于：• 滚环扩增（RCA）：环状DNA模板的线性/指数扩增• 多重置换扩增（MDA）：全基因组扩增（WGA），尤其是单细胞基因组扩增• 质粒体外酶促扩增（DNA酶法合成/dbDNA生产）• 锁式探…
两款都为突变过的phi29 DNA聚合酶，UniPhi29（14417ES）是在14404ES基础上升级而来，在大多数场景下表现更优，建议优先尝试UniPhi29。
UniPhi29 完整保留高活性 3'→5' 外切校对功能，扩增错配率远低于普通 Taq 酶；42℃高温体系减少模板二级结构导致的错配延伸，单细胞 WGA、RCA 扩增产物 NGS 测序 SNV 检测结果可靠，可用于低频突变、CNV 拷贝数变异分析。
提升反应温度至42℃；延长孵育时间，RCA 标准 4 h 可延长至 6 h；MDA 4 h 延长至 12–16 h；体系添加无机焦磷酸酶，解除焦磷酸产物对聚合酶的反馈抑制；小幅上调镁离子、硫代随机引物终浓度，梯度摸索最优区间；排查模板完整性，降解严重微量样本可适度提高模板投入量。
引物体系优化：下调硫代引物终浓度至 0.1–1 μM，检查引物是否存在分子内二聚体、3' 端错配；模板前处理：使用 Exo I+Exo III 消化未环化线性 DNA，消除线性模板引发的杂扩增；反应组分调整：dNTP mix降至 100–300 μM 区间，小幅降低镁离子浓度；外源污染排查：更换全新…
不可直接建库，必须完整预处理，三步缺一不可：热灭活终止反应：65℃孵育 10 min，彻底消除 UniPhi29 残留酶活，避免降解文库片段；磁珠纯化去除杂质：0.6–0.9× 磁珠两轮纯化，清除残留随机引物、dNTP、游离酶蛋白；片段化处理：超声或酶切打断高分子量分支 DNA 至 200–500 …
RCA产物的验证可通过以下方法：（1）限制性内切酶消化+琼脂糖凝胶电泳：在环状模板中设计单一切割位点，RCA产物经酶切后应产生均一长度的条带，可直观判断产物是否正确。这是最常用的验证方法。（2）荧光染料检测：使用SYBR Green或PicoGreen等dsDNA荧光染料，在反应体系中直接检测荧光信…
粘稠属于正常阳性现象：UniPhi29 强持续合成活性产生数十 kb 级高分子量分支 DNA，分子量越大粘稠度越高。标准化处理方案：稀释操作：电泳、Qubit 定量、磁珠纯化前用无核酸酶水稀释 2–10 倍，显著降低粘稠度；电泳验证处理：RCA 产物使用对应限制性内切酶单一位点切割，打散长串联多联体…
UniPhi29 完整保留 3'→5' 外切核酸酶校对活性，该酶活会无差别降解无保护的引物 3' 游离羟基末端。硫代修饰原理：将引物 3' 末端 1–2 个核苷酸磷酸二酯键氧原子替换为硫原子，抵御外切酶切割，稳定引物模板结合。随机六聚体引物、特异性线性引物、锁式探针配套引物的3'末端必须设计至少两个…
10298ES、10299ES（T4 DNA Ligase）可以用于分子克隆。使用时需将酶稀释至常规T4 DNA连接酶用于克隆的浓度，可直接用产品自带的buffer进行稀释，然后按照产品说明书的操作流程执行。
镁离子的问题，冻存偶尔会出现这种的，可在室温震荡溶解，或在不超过30℃环境下温热一会即可。
产生5’磷酸和3’磷酸的缺口Gap。作用机制是UDG 先切除 dU 碱基，形成一个 AP 位点（脱碱基位点），但此时磷酸二酯骨架仍保持完整，Endonuclease VIII 随即在 AP 位点通过 β,δ-消除反应 切断该位点 3' 端和 5' 端 的磷酸二酯键，将无碱基的脱氧核糖彻底释放，留下一…
sgRNA通过其5'端约20个核苷酸的引导序列，与基因组DNA上的特定靶标序列通过碱基互补配对原则结合，从而将Cas9蛋白精确地“引导”到目标DNA位置进行切割。
试剂盒提供的是基于 T7RNA 聚合酶的转录反应体系，含有能被 Cas9 蛋白识别并起支架作用的特异性序列，该序列的一部分能与使用者设计的目标特异序列部分重叠，退火形成互补链后由DNA 聚合酶进行填充生成用于转录的 dsDNA 模板，使用者需要自己设计的特异性 DNA 序列。
小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）和虾碱性磷酸酶（SAP）都可以去除载体或片段的5’-末端磷酸基团，但失活方法不同。小牛肠碱性磷酸酶，在底物浓度高时，CIAP的最适pH约为10；底物浓度低时，最适pH约为8，但特异性比高底物浓度时低。同时，其在保存条件下极其稳定，但在螯合剂存在条件下，经65℃、30分钟加…
小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）和虾碱性磷酸酶（SAP）都可以去除载体或片段的5’-末端磷酸基团，但失活方法不同。小牛肠碱性磷酸酶，在底物浓度高时，CIAP的最适pH约为10；底物浓度低时，最适pH约为8，但特异性比高底物浓度时低。同时，其在保存条件下极其稳定，但在螯合剂存在条件下，经65℃、30分钟加…