核酸提取与纯化FAQ

（1）可能是实验材料质量或样本量不足。（2）破壁或裂解不充分。植物要充分匀浆研磨充分，试剂盒中的破壁酶避免保存不当，洗脱液预热或多次过柱。

（1）可能是实验材料不新鲜或反复冻融。（2）提取过程中操作过于剧烈，DNA 被机械打断。解决方案：尽量使用新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融；液氮研磨或者组织匀浆后，后续操作尽量轻柔，DNA 洗脱液避免反复冻融。

（1）杂蛋白、RNA 污染。（2）乙醇残留。Wash buffer 中需添加无水乙醇或避免乙醇挥发； 空管离心，保证乙醇挥发彻底。

可能是提取产量低、DNA 出现降解或纯度低。DNA 提取实验包括样本预处理及DNA 提取两个环节，涉及到提取材料的新鲜程度、样本裂解-核酸的释放方式、柱结合能力等多个关键点。下面将可能的原因及解决方案总结如下：

可以的，-20℃保存建议不超过1周。

起始菌液量 2-6 mL，提取产量 5-35 μg。

不建议省略去蛋白液，会影响提取的纯度；洗脱可以用无酶水替代。

可能存在以下原因：(1)拷贝数低或者大于10kb的质粒应加大菌体使用量，并按比例增加后续buffer的用量；(2)细菌可能没有充分裂解。

裂解液中含有NaOH，低温状态下可能存在盐离子析出，可 37℃温浴复溶至溶液澄清再使用。

可能RNA未去除干净（样本太多或者添加了RNase的缓冲液 RS酶活下降）或者裂解时间太长导致质粒受到破坏。

可能是本身内毒素低，也可能是加入 ER 溶液后，因为体系的 PH 差异、抑制物等，使得内毒素的凝集状态反应不一样。

可能原因如下：（1）拷贝数低或者大于10kb的质粒应加大菌体使用量，并按比例增加后续buffer的用量（2）细菌可能没有充分裂解

裂解液中含有NaOH，低温状态下可能存在盐离子析出，可 37℃温浴复溶至溶液澄清再使用。

可能RNA未去除干净（样本太多或者添加了RNase的缓冲液 RS酶活下降）或者裂解时间太长导致质粒受到破坏。

提升离心温度；加大离心转速；增加离心时间。

可能原因如下：中低拷贝质粒：长片段、表达型载体常以低拷贝为主，建议加大菌体使用量，菌液过夜培养菌种问题：菌种保存中质粒丢失，养菌前先划线活化，稳定产量菌体未充分裂解：在buffer种充分重悬，避免成团试剂准备有误：有沉淀析出的溶液需要加热；加入的乙醇体积不准洗脱不充分：洗脱液预热，二次洗脱

可能原因如下：培养时间太长：培养时间建议控制在12-16h；裂解不充分：确保裂解后菌液应清亮粘稠。

提取体积大，产量高：150~300 mL，0.5~2 mg，提取率高达 80-90%，内毒素含量极低（

冰浴 5 min，冰浴过程中，颠倒混匀 2-3 次至溶液变清亮透明（或稍有浑浊），不澄清可能跟菌的种类和状态有关系。

推荐使用动态浊度法内毒素检测鲎试剂（货号60401ES)检测内毒素含量。