qPCR系列FAQ

双峰Tm 都在 80℃以前的可能原因：做 MicroRNA 定量时存在引物二聚体。Micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十 bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故会在 80℃ 以前出现双峰。…

可能原因：a）引物特异性过差导致非特异性产物扩增。b）交叉污染。c）gDNA 污染，可通过 NRC 进行确认。解决方案：a）Blast 检查引物特异性，差则重新设计引物。b）超净台中操作，注意更换 Tip 头，避免交叉污染。通过 NRC 阴性对照进行确认，若有，需重新制备模板。

可能原因：扩增产物是完全的引物二聚体，可能是未加模板。注：若 microRNA，则结果正常（做 microRNA 定量时存在引物二聚体。micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应 Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值…

可能原因：存在大小相近的非特异性扩增解决方案：a）温度跨度不高于 7℃，视为可用结果（即 Tm 值跨度＜7℃可认为是同一种产物）；b）进行高浓度琼脂糖电泳（高分辨率），确认是否为单一条带。

(1)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5-10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在 20-30 之间的最佳上样量。（2）常用的量是逆转录 500-1000ng 总RNA，稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行qPCR 实验…

(1)有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为-3--3.5。R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。（2）扩增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无Ct 值。（3）…

可能原因：a）RNA 纯度低，体系中存在较多杂质；推荐参数：OD260/OD280=1.8-2.0， OD260/OD230＞2.0。随着 qPCR 反应的进行，阻碍反应的因素不断增加，若 RNA 纯度低，杂质多，会进一步影响仪器平台期的算法，导致出现锯齿状。b）仪器长时间未做校准。仪器未校准会使仪…

可能原因：a）模板量太低（CT 值 35 左右）。推荐 Ct 值：15＜Ct＜30。原因：Ct 值太大（如 Ct＞30），刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。 b）循环次数太少（30 cycles）；循环次数过少（如 35）导致刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平…

较低峰 Tm 在 80℃之前可能原因：存在引物二聚体（一般mRNA 反转录后定量，产物在 100-150bp 左右，峰对应 Tm 值为 80-90℃。若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现一个峰， 80℃以后出现一个峰），模板浓度…

应用于病毒检测，特点是高检出率

加样误差。加大模板稀释倍数，提高加样体积，使不同稀释度的加样体积更准确；标准品降解。重新制备标准品；模板浓度太高。存在反应抑制，增加模板稀释倍数； 引物扩增特异性不好。重新设计引物。

反应循环数不够，可适当增加循环次数。一般设置为 40，需注意过多的循环会增加背景信号，降低数据可信度；确认程序中是否设置了信号采集步骤。三步法扩增程序应该将信号采集设置在 72℃延伸阶段， 两步法一般在退火延伸阶段收集；确认引物是否降解。长时间未使用的引物应先通过PAGE 电泳检测完整性； 模板浓度…

加样体积不准。定期校正移液器，将模板高倍稀释，以大体积加入反应体系中； 定量PCR 仪器不同位置温度控制不一致，定期校准仪器；模板浓度太低。模板浓度越低，重复性越差； 做 4-6 个复孔，删除其中重复性不好的孔。

Nuclease-Free water、DEPC 水或实验室自备的 ddH2O 都可以。不推荐使用 TE 作为稀释液，TE 里有EDTA 会抑制酶的活性。

茎环法和加A法都可以用于miRNA的反转录。茎环法最大的特点是其逆转录和qPCR都是序列特异性的。但由于茎环引物的特异性，针对同一样本中不同的目的miRNA，需要配制不同的逆转录体系。简单来说，就是茎环法特异性更好，但需要设计茎环引物，并且一次逆转录只适用于一个miRNA。加A法相对更简单一些，但它…

11172属于染料法检测，11173属于探针法检测。

有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为 -3--3.5。 R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。（2）扩 增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无 Ct 值。（…

以 2 μL 质粒 10 倍梯度稀释液（10^6 至 10^0 拷贝）为模板扩增人 IL23R 基因，可稳定检出 7 个数量级的模板范围，扩增效率高、线性关系良好，最低可检测到 10^0（即 1 个拷贝）级别的模板。

同样的扩增产物也会出现Tm 值有微小差异，一般差异在 1 度以内都可以接受。

一般 CT 值与模板起始浓度呈负相关，浓度越高，CT 值越小。但也有很多特殊情况， 比如体系中存在抑制物或是模板不纯，这时候稀释模板反而能使 CT 值变低。