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多点突变试剂盒可一步实现目标质粒上 3-5 个不连续位点的定点突变，而定点突变试剂盒是适合 1 或 2 个不连续位点的定点突变。如：3 个连续的碱基突变算 1 个位点的突变，故定点突变试剂盒即可（相距超过 50 bp 为 1 个不连续位点）。

点突变过程需要去除模板质粒，防止假阳性。利用的原理就是限制性内切酶DpnI 能消化甲基化的模板，若是非甲基化，则无法去除模板。

a）PCR 模板应为甲基化质粒，应使用甲基化酶无缺陷型的宿主菌扩增原始质粒（如DH5α， TOP10，JM109 等）。b）应尽量使用新鲜制备的质粒作为模板，因长期放置，反复冻融可能会导致模板质粒断裂， 开环或降解。

正反向扩增引物 5’端包含至少 20 bp 反向互补区域，各引物非互补区域长度至少为 20 bp。互补区尽量选择无重复序列，GC 含量尽量在 40%-60%范围内。

大于 5kb 连接成功的概率非常低，理论上不可以。

不可以，TOPO 异构酶具有限制性内切酶活性，时间过长会重新切割重组质粒，建议反应时间不超过 5min。

可以替代。区别：原理不一样，Takara 试剂盒利用的是 T4 连接酶，我们是 TOPO 异构酶，TOPO 异构酶更快更高效。

1）自杀基因 CCDB 是指无片段插入该基因中时，该基因会表达蛋白杀死细菌，使克隆无法生长，CCDB 基因的序列是保密的。2）CCCTT 序列是指拓扑异构酶能够偶联的序列。

不可以。试剂盒中含有偶连了拓扑异构酶的商业化载体，客户自己的载体没有偶连拓扑异构酶，无法直接连接。

后续需要改造质粒涉及到酶切就选购 10910，无这种需求的可以选购不含多克隆位点的产品。

不用酶切，直接连接就可以。

TOPO 克隆试剂盒都是 1.8kb，这个载体已经被修饰了，电泳跑出来会大于 2kb。

推荐氨苄抗生素浓度为100μg/ml。

应避免选择克隆位点上下游 50 bp 内有重复序列的区域。并且克隆位点上下游 20 bp区域内 GC 含量尽量在 40%-60%范围内。

酶切（包括单酶切和双酶切，建议双酶切降低质粒载体自连概率）或反向PCR。

载体使用量应大于 0.01 pmol，推荐使用量 0.03 pmol；克隆载体与目的片段摩尔比应在 2:1-1:5 范围内，最适为 1:2-1:3，超过范围可能会影响克隆效率。

会。线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应，会产生较高的假阳性或抑制反应。建议割胶回收纯化产物。

可以用，线性化载体是通过反向PCR 方式制备。氨苄抗性。不提供终载体。

最小建议 100bp 以上，过短的片段可能会被核酸外切酶完全切除掉。最大 10kb， 一般片段越大，难度系数更高些。

不是必需搭配。推荐使用转化效率为 107 cfu/μg 以上的感受态细胞。如 Yeasen的 DH5α（cat NO. 11802ES），TOP10（cat NO. 11801ES）等。可以电转，但要用电转感受态。