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-80ºC 保存没有测试过，建议用-20ºC 保存。

用无菌水稀释即可，稀释后能保存多久暂未有明确验证数据，建议现稀释现用。

a）原理是具有 3’-5’的核酸外切酶活性，即有校正功能。b）Taq 酶错配率：2*10-4，0.0002，大约5kb 有一个碱基发生突变。Canace 约0.00039%，是 taq 酶的 52 倍。c）高保真酶是突变概率低，但不是绝对的不突变。

仅供参考：先对平末端PCR 产物纯化后，浓度要求至少 20ng/ ul（跑胶图像条带清晰，明亮即可），取 14.5 ul PCR 产物，加入 2 ul Taq Buffer，3ul dNTP，0.5 ul Taq酶，在 72℃反应 10~20min, 后直接回收纯化加A 尾的DNA 片段。

验证范围内长度理论上是可以的（验证范围：简单模板 20kb，复杂模板 10kb）。但具体能否扩出，还与模板和引物等有关。

原因 1：模板突变。 1.原始模板序列有突变。原因：原始模板序列有突变会使扩增产物的突变位点恒定，表现在多个克隆测序发生突变，且突变位置恒定。判断方法：将模板与 T 载体连接产生的克隆送测序，测序结果与模板序列对比，发生突变且位置恒定，可认为是模板序列发生突变。优化方法：更换序列正确的模板。2.保存…

10102ES 和 10103ES 同属 2× Hieff® PCR Master Mix 系列，核心区别只有一个：是否含溴酚蓝染料。10102ES后续可直接进行凝胶电泳。而 10103ES中无溴酚蓝指示剂，电泳时需要添加DNA loading buffer。

不建议，PCR Mx 中含有影响 PAGE 胶电泳的成分。推荐使用2× Hieff® PCR Master Mix for PAGE（Cat No.10160ES)

可能原因：模板量太低（CT 值 35 左右）。推荐 Ct 值：15＜Ct＜30。原因：Ct 值太大（如 Ct＞30），刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。b）循环次数太少（30 cycles）；循环次数过少（如 35）导致刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。…

较低峰 Tm 在 80℃之前可能原因：存在引物二聚体（一般mRNA 反转录后定量，产物在 100-150bp 左右，峰对应 Tm 值为 80-90℃。若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现一个峰， 80℃以后出现一个峰），模板浓度…

双峰Tm 都在 80℃以前的可能原因：做 MicroRNA 定量时存在引物二聚体。Micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十 bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故会在 80℃ 以前出现双峰。…

可能原因：引物特异性过差导致非特异性产物扩增。交叉污染。c）gDNA 污染，可通过 NRC 进行确认。解决方案：Blast 检查引物特异性，差则重新设计引物。超净台中操作，注意更换 Tip 头，避免交叉污染。c）通过 NRC 阴性对照进行确认，若有，需重新制备模板。

可能原因：扩增产物是完全的引物二聚体，可能是未加模板。注：若 microRNA，则结果正常（做 microRNA 定量时存在引物二聚体。micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应 Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值…

可能原因：存在大小相近的非特异性扩增解决方案：a）温度跨度不高于 7℃，视为可用结果（即 Tm 值跨度＜7℃可认为是同一种产物）；b）进行高浓度琼脂糖电泳（高分辨率），确认是否为单一条带。

ROX 是一种参比染料，其作用是标准化荧光定量反应中的非PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。

常用 2 步法。需提高扩增特异性，可选用 2 步法或提高退火温度。在扩增效率低， ct 值过大的时候，可以改用 3 步法或延长延伸时间。

有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为 -3--3.5。 R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。（2）扩 增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无 Ct 值。（…

同样的扩增产物也会出现Tm 值有微小差异，一般差异在 1 度以内都可以接受。

一般 CT 值与模板起始浓度呈负相关，浓度越高，CT 值越小。但也有很多特殊情况， 比如体系中存在抑制物或是模板不纯，这时候稀释模板反而能使 CT 值变低。

可能是目的基因为低丰度表达基因导致。建议：a）换用内参；b）换引物；c）换检测线性范围更广的qPCR mix。