可以先混合大体系，再分别加到离心管里面，最后加模板；枪头加样不要把空气打进去，二档吸样，一档打样品；缓慢推出液体，不要吹打；沿着壁打入到孔内；另外配置完后，如果还有气泡，离心PCR管去除。如果是96孔板，移液完后轻轻敲96孔板。
沉淀是稳定剂冻存后溶解度下降析出形成的，不影响产品性能。建议解冻后上下颠倒，枪头吹打混匀至沉淀消失。若仍未溶解，可离心后取液体，请避免取到该沉淀。
11185特异性更好，灵敏度更高，平台期荧光信号值更高。
(1)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5-10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在 20-30 之间的最佳上样量。(2)常用的量是逆转录 500-1000ng 总RNA，稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行qPCR 实验…
(1)有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为-3--3.5。R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。（2）扩增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无Ct 值。（3）…
可能原因：a）RNA 纯度低，体系中存在较多杂质；推荐参数：OD260/OD280=1.8-2.0， OD260/OD230＞2.0。随着 qPCR 反应的进行，阻碍反应的因素不断增加，若 RNA 纯度低，杂质多，会进一步影响仪器平台期的算法，导致出现锯齿状。b）仪器长时间未做校准。仪器未校准会使仪…
可能原因：a）模板量太低（CT 值 35 左右）。推荐 Ct 值：15＜Ct＜30。原因：Ct 值太大（如 Ct＞30），刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。 b）循环次数太少（30 cycles）；循环次数过少（如 35）导致刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平…
较低峰 Tm 在 80℃之前可能原因：存在引物二聚体（一般mRNA 反转录后定量，产物在 100-150bp 左右，峰对应 Tm 值为 80-90℃。若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现一个峰， 80℃以后出现一个峰），模板浓度…
双峰Tm 都在 80℃以前的可能原因：做 MicroRNA 定量时存在引物二聚体。Micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十 bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故会在 80℃ 以前出现双峰。…
可能原因：a）引物特异性过差导致非特异性产物扩增。b）交叉污染。c）gDNA 污染，可通过 NRC 进行确认。解决方案：a）Blast 检查引物特异性，差则重新设计引物。b）超净台中操作，注意更换 Tip 头，避免交叉污染。通过 NRC 阴性对照进行确认，若有，需重新制备模板。
可能原因：扩增产物是完全的引物二聚体，可能是未加模板。注：若 microRNA，则结果正常（做 microRNA 定量时存在引物二聚体。micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应 Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值…
可能原因：存在大小相近的非特异性扩增解决方案：a）温度跨度不高于 7℃，视为可用结果（即 Tm 值跨度＜7℃可认为是同一种产物）；b）进行高浓度琼脂糖电泳（高分辨率），确认是否为单一条带。
(1)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5-10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在 20-30 之间的最佳上样量。（2）常用的量是逆转录 500-1000ng 总RNA，稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行qPCR 实验…
(1)有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为-3--3.5。R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。（2）扩增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无Ct 值。（3）…
可能原因：a）RNA 纯度低，体系中存在较多杂质；推荐参数：OD260/OD280=1.8-2.0， OD260/OD230＞2.0。随着 qPCR 反应的进行，阻碍反应的因素不断增加，若 RNA 纯度低，杂质多，会进一步影响仪器平台期的算法，导致出现锯齿状。b）仪器长时间未做校准。仪器未校准会使仪…
可能原因：a）模板量太低（CT 值 35 左右）。推荐 Ct 值：15＜Ct＜30。原因：Ct 值太大（如 Ct＞30），刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。 b）循环次数太少（30 cycles）；循环次数过少（如 35）导致刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平…
较低峰 Tm 在 80℃之前可能原因：存在引物二聚体（一般mRNA 反转录后定量，产物在 100-150bp 左右，峰对应 Tm 值为 80-90℃。若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现一个峰， 80℃以后出现一个峰），模板浓度…
应用于病毒检测，特点是高检出率
加样误差。加大模板稀释倍数，提高加样体积，使不同稀释度的加样体积更准确；标准品降解。重新制备标准品；模板浓度太高。存在反应抑制，增加模板稀释倍数； 引物扩增特异性不好。重新设计引物。
反应循环数不够，可适当增加循环次数。一般设置为 40，需注意过多的循环会增加背景信号，降低数据可信度；确认程序中是否设置了信号采集步骤。三步法扩增程序应该将信号采集设置在 72℃延伸阶段， 两步法一般在退火延伸阶段收集；确认引物是否降解。长时间未使用的引物应先通过PAGE 电泳检测完整性； 模板浓度…