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加样体积不准。定期校正移液器，将模板高倍稀释，以大体积加入反应体系中； 定量PCR 仪器不同位置温度控制不一致，定期校准仪器；模板浓度太低。模板浓度越低，重复性越差； 做 4-6 个复孔，删除其中重复性不好的孔。

Nuclease-Free water、DEPC 水或实验室自备的 ddH2O 都可以。不推荐使用 TE 作为稀释液，TE 里有EDTA 会抑制酶的活性。

茎环法和加A法都可以用于miRNA的反转录。茎环法最大的特点是其逆转录和qPCR都是序列特异性的。但由于茎环引物的特异性，针对同一样本中不同的目的miRNA，需要配制不同的逆转录体系。简单来说，就是茎环法特异性更好，但需要设计茎环引物，并且一次逆转录只适用于一个miRNA。加A法相对更简单一些，但它…

11172属于染料法检测，11173属于探针法检测。

有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为 -3--3.5。 R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。（2）扩 增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无 Ct 值。（…

以 2 μL 质粒 10 倍梯度稀释液（10^6 至 10^0 拷贝）为模板扩增人 IL23R 基因，可稳定检出 7 个数量级的模板范围，扩增效率高、线性关系良好，最低可检测到 10^0（即 1 个拷贝）级别的模板。

同样的扩增产物也会出现Tm 值有微小差异，一般差异在 1 度以内都可以接受。

一般 CT 值与模板起始浓度呈负相关，浓度越高，CT 值越小。但也有很多特殊情况， 比如体系中存在抑制物或是模板不纯，这时候稀释模板反而能使 CT 值变低。

可能是目的基因为低丰度表达基因导致。建议：a）换用内参；b）换引物。

可能原因是 ROX 添加不当。确认参比染料ROX 是否添加正确。

(1)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5-10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在  20-30  之间的最佳上样量。

这个是野生型的酶，活性中心封闭是利用配体法修饰的。

有末端转移酶活性。

可以使用Cat#15663ES，配方不完全一样，但可以替换。

一是该产品增强了与模板的亲和力，二是由于组分的设置，使得 RNA 最大投入量可以达到 12μL，对于低浓度模板可通过增大投入体积来增大模板投入量。

反转录后的产物是RNA和cDNA的杂交链，并不是DNA双链，其稳定性相较于后者来说要低一些。

下游通用引物是保密的。当前市面上常见到的加A法反转录试剂中，加上的带A序列是不一样的，均是根据自己的加尾酶设计并完善的，出于专利保护所以不做公开。

11149ES带有蓝色示踪剂，可提示加样进度。11150ES不带有示踪剂。经测试，添加一定量的示踪剂不影响反转录效率，后续qPCR的Ct值、熔解曲线峰值和TM值未受到负面影响。其它应用场景，如担示踪剂影响，可选11150ES。

其中的逆转录酶是通过改造后的，不具备Rnase H活性。

组分A为蓝色，具有加样示踪的作用，不建议用于下游LAMP等检测反应，可能会影响显色。