Q:
MDA/RCA 扩增产物非常粘稠是什么原因?如何处理适配下游实验?
粘稠属于正常阳性现象:UniPhi29 强持续合成活性产生数十 kb 级高分子量分支 DNA,分子量越大粘稠度越高。标准化处理方案:
- 稀释操作:电泳、Qubit 定量、磁珠纯化前用无核酸酶水稀释 2–10 倍,显著降低粘稠度;
- 电泳验证处理:RCA 产物使用对应限制性内切酶单一位点切割,打散长串联多联体,获得清晰均一条带;
- NGS 建库前处理:Covaris 超声打断至 200–500 bp 文库目标片段;
- 扩增阶段缓解:体系添加 0.1 U/μL 无机焦磷酸酶,从源头降低粘稠度,同时提升扩增产量。