Case Studies人初始CD4+ T细胞分化Th17细胞试验方案

一、包被anti-human CD3 mAb以激活T细胞

1. 使用无菌PBS（41403ES）将anti-human CD3 mAb（32102ES）稀释至工作浓度（5 µg/mL）。

2. 将稀释后的anti-human CD3 mAb按每孔1mL加入24孔细胞培养板中包被，在37°C条件下孵育2小时，或在4°C下孵育过夜。

二、接种细胞并启动Th17极化

1、次日，吸弃孔内包被液，用预冷的无菌PBS轻柔洗涤孔板2-3次，以去除未结合的抗体。

2、将CD4⁺T细胞分选试剂分选获得的初始CD4+ T细胞，以1×106 cells/mL的浓度重悬于Th17极化完全培养基中。

Th17极化完全培养基配方：RPMI-1640基础培养基（41402ES），补充10% FBS（40132ES）、55 μM β-巯基乙醇（52644ES）、30ng/mL重组人IL-6（90107ES）、20 ng/mL重组人IL-23（90225ES）、20ng/mL重组人IL-1β（90101ES）、10ng/mL重组人TGF-β1（91701ES）、10 μg/mL anti-human IL-4功能性抗体、10 μg/mL anti-human IFN-γ功能性抗体及1 μg/mL anti-human CD28 mAb。

3、取1 mL细胞悬液接种至已包被的24孔板中。置于37°C、5% CO₂的细胞培养箱中培养。

三、培养维持与细胞扩增

1、培养48小时后，轻柔吹打并收集细胞悬液，300 ×g离心5分钟。

2、弃上清，用新鲜的Th17极化完全培养基将细胞重悬，并将细胞密度调整至3×10^5 cells/mL，重新接种至新孔板中继续培养。

3、此后，每12小时在倒置显微镜下观察细胞密度及状态。若细胞密度过高（例如>2×106 cells/mL），则进行半量换液或按适当比例将细胞分至新的孔中，并补充新鲜Th17极化完全培养基（不用加anti-human CD28 mAb）以维持细胞最佳生长状态。

四、细胞再刺激与胞内因子捕获

培养至第5天，收集细胞，用预冷的PBS（41403ES）洗涤一次后，使用含 10 ng/mL PMA（50601ES）、1 µg/mL Ionomycin（50401ES）及10 µg/mL Brefeldin A （50504ES）的RPMI-1640（41402ES）完全培养基重悬细胞，调整密度至1×106cells/mL，于37°C、5% CO₂培养箱中避光共刺激孵育5小时。

五、 阴性对照组（Th0）设置

为评估极化的特异性，平行设置Th0阴性对照组。其流程与上述Th17诱导组基本相同，主要区别在于所使用的培养基不同：

1. Th0维持培养基配方：RPMI-1640基础培养基（41402ES），补充10 % FBS（40132ES），55 μM β-巯基乙醇（52644ES），10μg/mL Anti-human IL-4，10μg/mL Anti-Human IFN-γ，40ng/mL IL-2及1 µg/mL anti-human CD28 mAb。

2. 不添加极化细胞因子：该培养基中不添加极化细胞因子。

除上述差异外，细胞接种、换液、密度监控均与Th17诱导组相同。

六、流式细胞术检测

1. 收集细胞：细胞诱导后，弃培养基上清，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将贴壁细胞用PBS轻轻吹打重悬；

2. 计数：用细胞计数仪计数并计算细胞总数，300×g，离心5min，弃上清；

3. 死活染料染色：按照100μL/1e6浓度加入稀释好的死活染料Fixable Viability Dye 452 (稀释方法参考说明书）;

4. 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，300×g，离心5min，去除残留的死活染料；

5. 细胞固定：用PBS将细胞按照1e7/ml重悬，100μL/孔加至96孔板，300×g，离心5min，弃上清；每孔加入200μL 4% PFA，室温避光放置15min;

6. 洗涤细胞：300×g，离心5min，弃上清；每孔加200μLPBS，300×g，离心5min洗涤细胞，去除残留的固定剂；

7. 细胞破膜：每孔加入200μl fixation/permeabilization solution（BD 554714），4~8℃冰箱孵育30min；

8. 细胞封闭：每孔加入100μL 1×BD Perm/Wash™ Buffer，并加入Human IgG进行细胞封闭（步骤7与步骤8可同时进行），随后300×g，离心5min，弃上清；

9. 孵育抗体：每孔加入100μL 1×BD Perm/Wash™ Buffer并加入孵育抗体IL-17A Monoclonal Antibody (eBio64DEC17), PE-Cyanine7(抗体用量参考说明书）;

10. 洗涤细胞：300×g，离心5min，弃上清；每孔加200μl PBS，300×g，离心5min洗涤细胞，去除残留抗体，随后用100μL-200μL重悬细胞；

11. 上机检测。

注：仅供参考，最佳因子使用浓度和步骤请参考相关文献，根据具体实验条件和实验目的优化。

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重组人IL-23：维持和稳定Th17表型，使用浓度范围 10-50 ng/mL；

重组人TGF-β1：关键调节因子，使用浓度范围 1-10 ng/mL；

重组人IL-1β：强效促Th17因子，使用浓度范围 10-50 ng/mL。

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