Case Studies肝脏类器官培养案例 | 人肝脏类器官培养手册

肝脏是人体中最大的器官之一，来源于内胚层中前肠上皮细胞发育而来的肝芽结构，以代谢功能为主，发挥“解毒”作用。肝功能失衡会导致称为肝衰竭的病理状况，并导致肝炎、纤维化、肝硬化、癌症、代谢或自身免疫性疾病。因此，为充分了解每种肝病的表型和损伤器官的机制，我们需要体外个性化肝模型系统进行疾病建模、药物发现和药物毒性学习。

肝脏类器官(hepatic organoids, HLO, HO)是肝脏功能的3D模型，保留了肝细胞的主要生理特征。在存在或不存在基质的情况下，可以从iPSC、ESC或特定的成体细胞（例如上皮细胞或上皮细胞和间充质细胞）生成类器官。

我们根据JCI Insight^[1]、Cell Metab^[2]和J Hepatol^[3]发表的三篇文章，整理了由人类诱导多能干细胞(human iPSCs)生成肝脏类器官的培养方案。

图1.iPSC分化为肝类器官的过程(PMID: 28878125)^[1]

A：iPSC分化为肝类器官的示意图；

B-C：在第0天(iPSCs)、第3天（定形内胚层，EN）、第6天（前肠，FG）、第9天（成肝细胞，HB)、第20天(HO1)和第62天(HO2)在HO发育过程中发生的形态学和细胞标记变化。

iPSC在含有5 mM EDTA和10 mM Y-27632（Cat# 53006ES）或Y-27632 dihydrochloride（Cat# 52604ES）的缓冲液解离为单个细胞，接种到低吸附的6孔板上，然后用含有激活素A (100 ng/mL)和BMP4 (10 ng/mL)的RPMI-1640培养基培养3天；

第3 -6天，更换为含有1-2% Matrigel和B27的RPMI培养基，培养基中加入50 ng/mL FGF10；第6-9天，更换培养基，RPMI 中加入B27，FGF10 (10 ng/mL) ， BMP4 (10 ng/mL)，基质胶浓度维持为1-2%；

第9天后，收集前肠样结构，更换为含有1% Matrigel、50 ng/mL HGF、50 ng/mL Oncostatin M和10 μM Dexamethasone的类器官生长和分化培养基(HCM)中。

图2.iPSC分化为肝类器官的过程(PMID: 31155493)^[2]

A：iPSC分化为肝类器官的示意图；B：在第0天(iPSCs)和第20天(HLO)明场图像。

解离HO1：在第20天收集培养物，1 mg/mL胶原酶，孵育37°C，30 min，再0.25% Trypsin-EDTA，10 min，200 g离心3 min收集细胞。

重编程为HO2：重悬于50 μL Matrigel中，接种到24孔板中。Matrigel凝固后，加入1 mL生长培养基(RPMI-1640, B27, 250 nM LDN-193189, 3 μM CHIR-99021, 10 μM A 83-01, 100 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF10和20 ng/mL HGF)，培养细胞6天，更换为分化培养基(HCM medium, 10 μM DAPT, 10 ng/mL Oncostatin M, 20 ng/mL HGF, 10 μM Dexamethasone, 10 ng/mL BMP4)再培养6天。

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[1] Guan Y, et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2017 Sep 7;2(17):e94954.

[2] Ouchi R, et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metab. 2019 Aug 6;30(2):374-384.e6.

[3] Mun SJ, et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. J Hepatol. 2019 Nov;71(5):970-985.

（本文中的实验方案基于已发表文献优化整理，内容仅供参考，实际实验条件可能因细胞系差异、实验室环境等因素需调整，建议用户在正式实验前进行预实验优化。）