Case Studies干细胞&小分子化合物 | 胰腺干细胞体外培养与扩增案例

适用细胞模型：

人 ES 细胞系（H1、H9）、人iPS细胞系：核心分化模型，需维持核型正常、无支原体污染、多能性标志物阳性率≥95%

293T 细胞：用于基因编辑载体构建与病毒包装

hPSCs 需在无饲养层体系中稳定传代 3 代以上，融合度 70%-80% 时传代，无分化克隆，Oct4/Sox2 双阳性率≥95%。

分步诱导实验步骤（总周期 21 天）

1) 阶段 1：定型内胚层（DE）诱导

• Day 0：将 hPSCs 消化为单细胞悬液，以 1×10⁵个 /cm² 的密度接种于 Matrigel 包被的培养板，使用 TeSR 培养基(Cat#44501ES) + 10 μM Y-27632（Cat# 53006ES）（ROCK 抑制剂）接种，培养 12-16 小时至细胞贴壁。
• Day 0-Day 1：弃去培养基，更换DE 诱导培养基 1：RPMI1640 基础培养基 + 100 ng/mL Activin A + 3 μM CHIR99021 + 0.2% 胎牛血清（Cat# 40132ES）（FBS），培养 24 小时。
• Day 1-Day 3：弃去培养基，更换DE 诱导培养基 2：RPMI1640 基础培养基 + 100 ng/mL Activin A + 0.2% 胎牛血清，每 24 小时换液，持续培养 48 小时。
• 质控节点（Day 3）：流式细胞术检测 SOX17/FOXA2 双阳性率，需达到 85%-95%，未达标需终止分化，排查细胞状态与试剂活性。

图1 hiPS 细胞向定型内胚层分化的诱导方案、标志物表达定量及免疫荧光结果

2) 阶段 2：原肠管（PGT）诱导

• Day 3-Day 5：弃去 DE 诱导培养基，PBS 轻柔洗涤 1 次，更换PGT 诱导培养基：DMEM/F12 （Cat#41406ES）基础培养基 + 50 ng/mL FGF7 + 0.5% B27（Cat# 60711ES） 添加剂，每 24 小时换液，持续培养 48 小时。
• 质控节点（Day 5）：细胞呈上皮样单层生长，无明显分化克隆，免疫荧光检测 HNF1β、FOXA2 阳性率≥90%。

3) 阶段 3：胰腺前体细胞（PP1）诱导

• Day 5-Day 7：弃去 PGT 诱导培养基，PBS 轻柔洗涤 1 次，更换胰腺前体细胞诱导培养基：DMEM/F12 基础培养基 + 50 ng/mL FGF7 + 2 μM 视黄酸 + 100 nM LDN193189 + 0.25 μM KAAD-Cyclopamine + 0.5% B27 添加剂；可选优化：加入 1 μM Indolactam V 可提升 PDX1 阳性率，每 24 小时换液，持续培养 48 小时。
• 质控节点（Day 7）：流式细胞术检测 PDX1/NKX6.1 双阳性率，需达到 70%-85%，为合格胰腺前体细胞。

图2 hiPS 细胞向胰腺前体细胞分化的诱导方案、PDX1 阳性率定量及胰腺标志物表达结果；ILV 诱导干细胞向胰腺谱系分化的免疫荧光及标志物qPCR验证结果

4) 阶段 4：内分泌前体细胞（PP2）诱导

• Day 7-Day 10：弃去胰腺前体细胞诱导培养基，更换内分泌前体细胞诱导培养基：DMEM/F12 基础培养基 + 100 nM LDN193189 + 10 μM SB431542 + 1 μM 三碘甲状腺原氨酸 + 10 mM 烟酰胺 + 0.5% B27 添加剂，每 24 小时换液，持续培养 72 小时。
• 质控节点（Day 10）：免疫荧光检测 NGN3、NEUROD1 阳性细胞占比≥30%，提示内分泌谱系特化成功。

5) 阶段 5：β 细胞前体诱导

• Day 10-Day 13：弃去内分泌前体细胞诱导培养基，更换β 细胞前体诱导培养基：DMEM/F12 基础培养基 + 1 μM 三碘甲状腺原氨酸 + 10 mM 烟酰胺 + 10 μM ALK5 抑制剂 II（替代 SB431542） + 0.5% B27添加剂，每 24 小时换液，持续培养 72 小时。
• 质控节点（Day 13）：免疫荧光检测 INS（胰岛素）、NKX6.1 双阳性细胞占比≥5%。

6) 阶段 6：成熟 β 样细胞诱导

• Day 13-Day 21：弃去 β 细胞前体诱导培养基，更换β 细胞成熟培养基：DMEM/F12 基础培养基 + 1 μM 三碘甲状腺原氨酸 + 10 mM 烟酰胺 + 0.5% B27 添加剂；可选优化：加入 10 μM Forskolin + 10 μM 地塞米松，每 48 小时换液，持续培养 8 天。
• 质控节点（Day 21）：流式细胞术检测 INS/C 肽双阳性细胞占比 8%-15%，葡萄糖刺激胰岛素分泌实验（GSIS）刺激指数≥2.0，提示获得功能型 β 样细胞。

图3 干细胞来源 β 细胞的 C 肽 / 胰高血糖素免疫荧光共定位染色结果；诱导获得的胰岛素分泌细胞的 β 细胞标志物、胰岛激素免疫荧光结果

实验步骤：

• 细胞接种：将Day 7的胰腺前体细胞消化为单细胞，以 1×10⁵个 /cm² 的密度接种于 Matrigel 包被的培养板。
• 扩增培养：使用扩增培养基：DMEM/F12 基础培养基 + 50 ng/mL FGF7 + 2 μM RA + 100 nM LDN193189 + 0.25 μM KAAD-Cyclopamine + 100 ng/mL EGF + 0.5% B27 添加剂，每 2 天换液。
• 传代培养：细胞融合度达 80% 时，按 1:2-1:3 比例传代，最多连续传代 3 次。
• 干性验证：每代细胞需通过流式细胞术检测 PDX1/NKX6.1 双阳性率，阳性率≥70% 方可继续传代或分化；传代 3 代后需验证全谱系分化潜能。

实验结果：

7 天培养细胞扩增倍数 3-5 倍 / 代，连续传代 3 代总扩增倍数 10-15 倍；

传代 1-2 代，PDX1/NKX6.1 双阳性率维持 70%-80%；传代 3 代后，阳性率普遍下降至 60% 以下，分化潜能显著降低；

扩增后的前体细胞仍可分化为 INS⁺β 样细胞，但分化效率较未扩增细胞下降 10%-20%。

图4 不同处理条件下，PDX1 阳性胰腺前体细胞的增殖能力检测结果

实验步骤：

靶点设计：针对 MODY 糖尿病致病基因（GCK、HNF1A、HNF4A 等）、1 型糖尿病易感基因设计特异性 sgRNA，构建 sgRNA-Cas9 共表达载体。

细胞转染：将载体通过电转染方式导入 hPSCs，电转后接种于 Matrigel 包被的培养板，加入 mTeSR1 + 10 μM Y-27632 培养。

阳性筛选：电转 48 小时后，加入嘌呤霉素进行药筛 48 小时，去除未转染细胞。

单克隆鉴定：有限稀释法接种细胞，培养 10-14 天获得单克隆细胞株，PCR 扩增靶点区域进行 Sanger 测序，筛选纯合 / 杂合突变细胞株。

质控验证：对阳性克隆进行核型分析、支原体检测、多能性验证、全基因组脱靶检测，筛选无脱靶、核型正常、多能性完整的单克隆细胞系。

分化与表型鉴定：使用上述分化体系，将突变型 hPSCs 定向分化为胰腺前体细胞与胰岛类器官，通过免疫荧光、GSIS 实验、转录组测序验证疾病病理表型。

实验结果：

可成功获得 GCK、HNF1A 等致病基因突变的单克隆 hPSCs 细胞系，分化效率与野生型细胞无显著差异；

GCK 突变型胰岛类器官可复现葡萄糖感知功能障碍，高糖刺激下胰岛素分泌能力显著下降，与 MODY2 糖尿病临床病理特征一致；

HNF1A 突变型胰岛类器官可出现 β 细胞成熟障碍、胰岛素分泌功能下降，模拟 MODY3 糖尿病的病理改变；

单克隆筛选周期约 2-3 周，纯合突变株获得率约 5%-20%，存在显著的靶点差异与脱靶风险。

实验步骤：

样本收集：分别收集未诱导 hPSCs、Day3 定型内胚层、Day7 胰腺前体细胞、Day21 成熟胰岛类器官、人孕早期胎儿胰腺组织、成人胰岛组织样本，每组设置 3 个生物学重复。

RNA 提取：使用 TRIzol 试剂提取总 RNA，Nanodrop 与琼脂糖电泳检测 RNA 纯度与完整性，RIN 值≥7.0 方可用于建库。

文库构建与测序：构建 mRNA 测序文库，使用 Illumina 测序平台进行 PE150 测序。

数据分析：比对人参考基因组，进行差异表达基因分析、GO/KEGG 通路富集分析、主成分分析（PCA），验证样本间转录组特征相关性。

实验结果：

小分子诱导的胰腺前体细胞，胰腺发育相关基因（PDX1、NKX6.1、HNF6 等）显著富集，差异表达基因主要集中在内胚层特化、胰腺发生相关通路；

PCA 分析显示，胰岛类器官转录组特征与人孕早期胎儿胰腺具有最高的相似度，与成人成熟胰岛匹配度较低，符合胚胎胰腺发育特征；

糖尿病模型类器官的差异表达基因，与对应临床患者胰岛组织的差异基因高度重合，证实模型的疾病模拟能力。

图9：干细胞来源 β 细胞、原代 β 细胞的转录组聚类分析及差异基因热图