Case Studies人外周血单核来源树突状细胞的制备实验方案

一、PBMC复苏

复苏冻存的PBMC，室温300g离心5min。弃去上清，使用完全培养基RPMI 1640（41402ES）（含10% FBS40132ES和1%双抗60162ES）重悬细胞，并进行细胞计数与活率检测（活率应大于95%）。

二、单核细胞分选

方法A：贴壁纯化法（简便，适合常规实验）

1. 铺板：将分离得到的单个核细胞用含血清的完全培养基重悬，调整细胞密度至约1×106−2×106cells/mL，接种于6孔培养板中。

2. 贴壁：将培养板置于37℃、5% CO₂培养箱中静置培养2小时。此步骤利用单核细胞易贴壁的特性，使其与悬浮的淋巴细胞分离。

3. 去悬浮：轻轻吸弃培养基中的悬浮细胞（主要为淋巴细胞），并用温热的PBS（41403ES）轻轻洗涤培养孔1-2次，剩余的紧密贴壁细胞即为单核细胞。

方法B：CD14 磁珠分选法（高纯度，适合功能实验）

1. 重悬：PBMC 调整浓度至1×10⁸ cells/mL，用预冷分选缓冲液洗涤1次（4℃，300×g，8 min）。

2. 磁珠标记：将PBMC细胞加入分选磁珠，4℃孵育 30 min，轻柔混匀。

3. 磁分离：分选柱用3倍体积分选缓冲液润洗，加入细胞悬液，收集未结合细胞；用分选缓冲液洗柱3次，洗脱结合的CD14⁺单核细胞（纯度≥95%）。

三、单核细胞诱导为未成熟树突状细胞

1. 接种：用完全培养基RPMI 1640（含10% FBS和1%双抗）将分选后的CD14+细胞浓度调整至1-2×106 cells/mL。按每孔1 mL接种于24孔板中。

2. 诱导：立即加入重组人细胞因子IL-4（90105ES,50ng/mL）和GM-CSF（91102ES,100ng/mL），将24孔板(84013ES)置于37℃、5% CO2的培养箱中开始培养；

3. 观察：培养48h后，在显微镜下观察细胞状态。

4. 换液：若细胞贴壁良好：轻柔吸弃一半旧培养基，再缓慢加入等体积、含有相同浓度IL-4和GM-CSF的新鲜完全培养基；若细胞贴壁不佳或大量悬浮：无需弃去旧液，直接补加适量含有相同浓度细胞因子的新鲜完全培养基。继续培养：完成换液/补液后，将细胞继续培养72小时。形态观察：出现典型树突状突起，为未成熟MoDC（iMoDC）。

四、未成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞

1. 换液：轻柔吹打收集的上述未成熟树突状细胞，300g离心10分钟。弃去上清。用新鲜完全培养基重悬细胞，并将密度调整至5×105cells/mL。

2. 接种：将细胞悬液接种至新的24孔板中，并加入成熟诱导因子混合物：TNF-α（90635ES,10 ng/mL）、IL-1β（90101ES,10 ng/mL）、IL-6（90107ES,50 ng/mL）和PGE2（60810ES，1μg/mL）。将细胞置于37°C、5% CO₂培养箱中继续培养48小时。培养结束后，即可获得成熟的树突状细胞，用于后续实验。

3. 形态观察：随着细胞成熟，细胞会逐渐变成悬浮状态，细胞体积增大，表面突起变得更加细长、明显，呈典型的“树突状”。

五、细胞收获与鉴定

1. 收获：收集上清中的悬浮细胞，贴壁残留细胞用预冷TrypLE Express(40134ES)消化 5 min，轻轻吹打收集，合并后用PBS洗涤2次（300×g，10 min）。

2. 计数与活力：台盼蓝染色(40207ES)，活细胞率需≥85%。

3. 表型鉴定（流式细胞术）

未成熟DC标志：CD11c⁺、CD14⁻、CD80⁻/low、CD86⁻/low、MHC II⁺、CD83⁻。

成熟DC标志：CD83⁺、CD80⁺、CD86⁺、HLA-DR⁺（MHC II）、CD14⁻。

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重组人GM-CSF:能够诱导单核细胞或DC前体细胞向DC分化，并促进DC的增殖和存活,还可以提高DC表面抗原水平，增强DC的抗原捕获和处理能力

重组人IL-4:抑制单核细胞向CD14+巨噬细胞分化，从而诱导其分化为未成熟DC

重组人IL-6、重组人TNF-α和重组人IL-1β：三因子组合可诱导DC的完全成熟

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