Techniques细胞增殖与毒性常用的检测方法

细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础，是生物体的重要生命特征。细胞通常以分裂的方式进行增殖。细胞毒性（cytotoxic）是由细胞或化学物质引起的单纯细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。

通常细胞增殖和毒性的检测方法有以下几种：

① MTT检测法：

MTT是一种黄色染料，已经普遍用于细胞增殖与毒性检测。检测的原理在于：MTT是一种可接受氢离子的化合物染料，带正电荷，具有细胞膜渗透性。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源进入的MTT还原成为水不溶性的深蓝色MTT-甲臜结晶，而死细胞不具有此功能。

② CCK-8检测法：

CCK-8检测应该是目前应用得比较广泛得一种细胞毒性与增殖检测方法。CCK-8是Cell Counting Kit-8的简称，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。

CCK-8法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

相比于其他细胞增殖/毒性的检测方法，CCK-8检测法具有以下优势：

1. 产品为溶液，即开即用；

2. 细胞毒性低，细胞形态不变；

3. 检测时间短，适用于批量检测；

4. 试剂稳定性很好，检测时间短；

5. 产品非常便携，并且检测灵敏度高；

6. 酚红和血清对CCK-8法的检测不会造成干扰，重复性高。

③ LDH法检测：

检测原理：LDH (乳酸脱氢酶）在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，释放出的LDH 在培养基上清中，可通过酶反应来检测。在乳酸脱氢酶的作用下，NAD+被还原生成NADH，NADH和INT(a tetrazolium salt)被硫辛酰胺脱氢酶(Diaphorase)催化反应生成NAD+和红色的甲臜(Formazan)，甲臜的量与裂解的细胞数成正比，在490 nm波长下产生吸收峰，从而可以通过比色来定量乳酸脱氢酶的活性。吸光度与乳酸脱氢酶活性成线性正相关。

LDH检测原理示意图

还有其他几种其他方法可以通过反应细胞的存活率，间接的反应细胞的增殖和毒性。比如①阿尔玛蓝（Alamar Blue）是一种氧化还原指示剂，能根据代谢活性产生吸亮度变化和荧光信号。吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比。②台盼蓝（Trypan Blue）染色，一种偶氮、亲水性酸性蓝色染料，可透过死亡细胞和垂死细胞的细胞膜，将其染成蓝色，而活细胞由于其细胞膜的完整性，可将台盼蓝排斥在外，因此，通过颜色的变化即可将活细胞（活细胞呈透明无色）和死细胞鉴别开来。③磺酰罗丹明B（SRB）检测，磺酰罗丹明（Sulforhodamine B，SRB）是一种水溶性蛋白染料，能与细胞内蛋白碱性氨基酸结合形成复合物，其结合于细胞中总蛋白量的多少可以反映细胞数的多少。在515nm波长处测得的吸光值与细胞数呈良好的线性关系。

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