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Techniques攻无不“克”的无缝克隆为何备受青睐？

📂 克隆系列 Type ID 5006

👁 8,116 views 🗓 2026-10-12 Source ID：657

攻无不“克”的无缝克隆为何备受青睐？

Source: Yeasen Biotech ｜ Original: https://www.yeasen.com/solutiondetail/657 ↗

导读

在经历了多次PCR、酶切、连接、转化后，有些小伙伴仍会面临克隆阳性率低的情况，每一步都认真地完成，但仍然存在不少的问题。今天小翌给大家介绍一下近年来备受科学家们青睐的“无缝克隆”。相比于传统的酶切克隆，无缝克隆更快更灵活，不受酶切位点限制，可以在质粒的任何位点进行一个或多个DNA片段的插入。

传统酶切克隆

1. 受限制性内切酶的限制

2. 连接效率低：T4 DNA连接酶连接效率具有序列的偏好性

3. 耗时长：酶连过夜

4. 多片段克隆困难

图1.传统酶切克隆

无缝克隆

1. 无需考虑酶切位点，适用任意载体、任意片段

2. 阳性率高，可用于50 bp -10 kb的片段

3. 连接快速，20-30 min即可完成

4. 可用于多片段克隆、基因突变、多顺反子表达载体构建

图2.无缝克隆

无缝克隆的原理

与传统的双酶切克隆一般，无缝克隆依赖于dsDNA的黏性末端进行互补配对，但无缝克隆并不使用内切酶来制造黏性末端，而是通过T5核酸外切酶来产生的。T5核酸外切酶能够沿着5’→3’方向，降解dsDNA，从而产生黏性末端，但是，T5外切酶并不能保证每一个片段5’端都会酶切成一样长的粘性末端。因此退火之后，无缝克隆中的DNA聚合酶会针对缺失的碱基进行添加，Taq连接酶催化碱基之间形成磷酸二酯键，将所有缺口补齐。

图3.无缝克隆原理图

无缝克隆优势详解

1. 不受片段、载体序列的限制，可任意组装

传统的酶切克隆：克隆载体的多克隆位点需携带可用的单一酶切位点，同时酶切位点若存在于外源片段也会极大程度限制克隆。此外，还需要购买各式各样不同的内切酶。

无缝克隆：仅靠同源臂进行互补配对。

2. 可同时无缝地拼接多个片段

传统的酶切克隆：由于酶切位点的限制和酶切位点之间存在着一定的距离和交叉覆盖，可组装的片段有限，酶切克隆通常需要分多次拼接，一般只能拼接2-3个片段，耗时耗力。

无缝克隆：可同时拼接4-6个片段，并且只需要将所有片段混在一个试剂管中反应即可。

3. 操作简便，时间上大大节省

传统的酶切克隆：传统的片段和载体酶切均需要2-4小时，此外还需要对相关产物进行末端补平、磷酸化、产物纯化等一系列操作。为保证连接成功，还需在16℃条件下过夜连接。

无缝克隆：仅需PCR和胶回收，连接体系反应时间为20min左右，连接单个和多个片段的时间一致。相比于传统酶切克隆，可节约1天左右的时间。

无缝克隆操作步骤

图4.无缝克隆关键步骤

1. 线性化载体制备

① 线性化方式：酶切或者PCR；

② 产物纯化：胶回收/PCR产物纯化；

2. PCR获取目的插入片段

5’引物需要和线性化载体末端15-25 bp的序列重叠。

小翌推荐使用引物设计工具：https://www.yeasen.com/calculator.html#/double-enzyme/

3. 重组反应

按一定比例将线性化载体与插入片段进行混合，50℃反应20 min后即可用于转化。

分子克隆发展至今，翌圣利用同源同组的原理，匠心研发了多款一步法快速克隆产品。自产品上市以来，受到了诸多客户的支持，备受好评。以下是部分产品的性能展示：

图5. Hieff Clone^® One Step Cloning Kit（CAS#10911）试剂盒可以有效克隆不同长度的单片段基因。载体：4.7 kb。插入片段：1.2 kb，3 kb和5 kb。

图6.Hieff Clone^® Plus Multi One Step Cloning Kit（CAS#10912）试剂盒进行3个片段克隆。载体：10 kb。插入片段：1 kb，1.5 kb和2.5 kb。

图7.Hieff Clone^{^®} Universal One Step Cloning Kit（CAS#10922）试剂盒进行5个片段克隆（上）、6个片段克隆（下）。载体：5 kb。插入片段：4kb（上）和5 kb（下）。

产品已发表文献

1. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017. (IF 37.205)

2. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019. (IF 31.398)

3. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16. (IF 31.398)

4. Wang Y, Hu SB, et al. Genome-wide screening of NEAT1 regulators reveals cross-regulation between paraspeckles and mitochondria[J]. Nat Cell Biol. 2018 Oct;20(10):1145-1158. (IF 20.46)

5. Li X., et al., Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection[J]. Mol Cell. 2017 Jul 20;67(2):214-227.e7. (IF 14.548)

6. Yao R W, Xu G, Wang Y, et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus[J]. Molecular cell, 2019. (IF 14.548)

7. Wu P, Zhang T, Liu B, et al. Mechano-regulation of peptide-MHC class I conformations determines TCR antigen recognition[J]. Molecular cell, 2019, 73(5): 1015-1027. e7. (IF 14.548)

8. Qiao HH, Wang F, et al. An efficient and multiple target transgenic RNAi technique with low toxicity in Drosophila[J]. Nat Commun. 2018 Oct 8;9(1):4160. (IF 12.353)

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