Applications钙离子检测荧光探针专题

钙离子浓度变化是活细胞接受外界刺激后产生级联反应的重要信息传递方式，因此细胞内钙离子检测是信号转导G蛋白偶联受体（GPCR）介导的相关药物筛选以及其他相关实验中非常重要的一种研究手段，该领域中常使用钙离子荧光探针与钙离子的特异性结合来观察细胞内钙离子浓度水平的变化，此类探针未结合Ca²⁺前几乎无荧光，结合Ca²⁺后，荧光强度显著增强，所显示光谱可被荧光显微镜、流式细胞术、荧光光谱法以及荧光酶标仪等多种方法检测。

常用的Ca²⁺荧光探针根据波长的不同，分为两大类：

第一类：可见光激发Ca²⁺荧光探针

与紫外光激发的荧光探针相比，如Fura-2和Indo-1，可见光激发Ca²⁺探针具有以下特点：

1）适用于大多数的激光共聚焦测钙系统，包括共聚焦激发扫描显微镜以及流式细胞仪等。

2）具有更强的染料吸收性能，使得更低浓度的探针即可成功检测Ca²⁺变化，从而降低了对活细胞的光毒性。

3）Ca²⁺依赖性荧光强度增强，对Ca²⁺变化水平检测敏感度更高。

4）降低样品自荧光以及光散射的干扰。

5）兼容光激活探针以及UV-激发试剂，因此更方便于多参数检测。5）无光谱偏移。

介绍几种受欢迎的可见光激发Ca²⁺荧光探针：

1）Fluo-3

Fluo-3是常用的可见光激发Ca²⁺荧光探针，较高的Ca²⁺结合力可捕捉细胞内Ca²⁺信号的动力学变化，使用于多种流式细胞术相关实验，如笼锁Ca²⁺螯合剂光活化、第二信使、神经传导物质研究以及细胞水平的药物筛选等。Fluo-3游离配体几乎是非荧光性的，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。但是，当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，荧光会增加60至100倍，最大激发波长为 506nm，最大发射波长为 526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525～530nm。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。

2）Fluo-4

Fluo-4是钙指示剂Fluo-3的升级版本，主要变化为后者分子上的两个氯原子被Fluo-4上的氟所取代，该结构上的微小变化使Fluo-4,AM加载更快，在相同浓度下检测信号更强。

3）Rhod-2

Rhod-2是另一种可见光激发的高亲和力Ca²⁺指示剂，与其他可见光激发荧光探针如Fluo-3/4相比，Rhod-2具有长波长，更适用于检测具有较高自荧光现象的细胞和组织内钙离子水平以及检测由光感受器和笼锁Ca²⁺螯合剂光激活导致的钙离子释放。

图 Fluorescence emission spectra at equal concentrations of fluo-4 (blue) and fluo-3 (red) in solutions containing 0–39.8 µM free Ca²⁺.

你所不知道的秘密：为什么许多荧光探针会有R-AM或者R的形式提供？以Fluo-4或Fluo-4, AM为例。

常规的荧光探针如Fluo-4属极性大的酸性化合物，无法进入细胞内。此时，若想做细胞内染色，需要通过膜片微电极（patch pipette），显微注射（microinjection），胞引作用加载试剂等手段，辅助实现药物加载，何其麻烦！！

为此，而通过在Fluo-4的负性基团上结合乙酰氧甲酯（AM），该单一的变化既增加了酯溶性又消除了负电荷，极大的提高了细胞渗透性。只需要把细胞孵育在含药物的培养液中，即可实现加载，非常省事。而一旦Fluo-4 AM进入细胞后，酯化钙离子荧光探针被酯酶水解，恢复Fluo-4，在胞内完全发挥其正常生理功能。

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第二类：紫外光激发Ca2+荧光探针

Fura-2和Indo-1均属可见光激发Ca2+荧光指示剂，也是目前常用的比率测量荧光探针。与第一代染料Quin-2相比，Fura-2和Indo-1发出更强的荧光，在生理pH范围内对pH变化不敏感。与Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+等二价金属离子相比，对Ca2+有更高的选择性，因此得到了广泛应用，同时作为双波长荧光染料在标定Ca2+浓度时不再单纯依靠荧光强度的变化。

1）Fura-2

2）Indo-1

Fura-2是双激发波长荧光染料，Indo-1是双发射波长荧光染料，均采用比率测量方法，该方法可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗漏，细胞厚度差异等一些误差因素。Fura-2特别适合于数字成像显微镜，使用该设备可更方便的调整激发波长，使探针结合钙离子后在300-400nm的激发波长范围内扫描Fura-2的吸收偏移，在510nm处检测发射波长。相比之下，Indo-1更倾向于流式细胞术检测，使用该设备可实现在氩离子激光器的351-364光谱范围内单一波长的激发，在400nm和480nm的波长处分别检测结合钙离子和未结合钙离子的荧光信号，通过二者的比值确定钙离子的浓度。Fura-2,AM和Indo-1,AM分别是Fura-2和Indo-1的乙酰氧甲酯（AM）衍生物，具有活细膜渗透性。

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