Case StudiesT4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase)实战指南：NGS文库构建中接头连接优化方案

二代测序（NGS）凭借高通量、低成本、高分辨率优势，现已广泛应用于肿瘤液体活检、单细胞基因组分析、病原微生物检测、遗传变异筛查、群体基因组学等科研与临床检测领域。完整 NGS 检测流程分为核酸提取、文库构建、上机测序、数据分析四大环节，文库构建是承上启下的核心步骤，直接决定下机数据质量、有效比对率与突变检出灵敏度。其中接头连接作为文库制备关键节点，连接效果优劣会直接影响最终测序产出，是建库流程中不可忽视的关键环节。

标准 NGS 建库流程：DNA 片段化→末端修复 + 加 A 尾→接头连接→PCR 富集。

接头连接依靠 T4 DNA 连接酶将测序接头共价结合至 DNA 片段两端，赋予文库分子与测序芯片结合、扩增的能力。Illumina、MGI 两大主流平台接头结构存在差异，但二者连接反应均依赖 T4 DNA Ligase 催化完成。

图1. DNA建库流程示意图

T4 DNA 连接酶以 ATP 为辅因子，催化 DNA 5’磷酸端与 3’羟基端形成磷酸二酯键；建库场景中主要负责完成 dA 尾 DNA 与 dT 尾测序接头的 TA 粘性末端连接。

翌圣 Premium T4 DNA Ligase（14966ES）针对 NGS 建库场景专项优化，核心优势：

• 超凡热稳定性：42℃处理 4 小时仍保持 60% 以上酶活残留，在较宽温度区间内持续发挥高效酶活，无论是高温反应场景，还是高通量实验室温预装体系、多步实验室温衔接等复杂场景，都能稳定适配，无需担忧酶活衰减。
• 超低接头自连率：0.5 ng gDNA 建库实验中，接头自连率显著优于竞品，尤其适配肿瘤活检、单细胞测序、cfDNA 等微量样本建库，既能避免珍贵样本与接头浪费，又能减少无效序列干扰，保障数据真实性与精准度。

标准化接头连接操作方案

1、100 μL 标准连接反应体系：

【注】* 试剂盒内未提供50% PEG6000，需自行准备。

** 接头用量根据Input DNA量参考下表。

*** Premium T4 DNA Ligase用量可根据需要添加1-5 μL。

2、接头用量参考

接头质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。下表为不同Input DNA量推荐的Adapter使用比例：

【注】：Input DNA摩尔数(pmol)≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度(bp)]。

【接头添加计算举例】：当Input DNA为100 ng，Input DNA长度为300 bp时，接头应该添加多少？

第一步，计算Input DNA摩尔数。公式：Input DNA摩尔数(pmol)≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度(bp)]；

Input DNA摩尔数(pmol)=100 ÷(0.66×300)=0.5 pmol；

第二步，计算接头添加摩尔数。根据表2查询接头添加比例；

根据表2，查得Input DNA 100ng时接头添加比例100:1，则接头添加摩尔数=100×0.5 pmol=50 pmol；

第三步，计算接头添加体积。接头浓度=15 μmol/L（如使用其他接头，浓度需要依据其他接头浓度参数）；

接头添加体积=接头添加摩尔数(50 pmol)÷接头浓度(15 μmol/L)=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL）；

综上，接头可添加3.4 μL。（注：接头最大加入体积不超过5 μL）。

3、 反应操作步骤

① 按上述体系表，依次加入各组分，配制反应体系。

② 涡旋混匀，低速离心使粘附在管壁上的液体沉降至管底。

③ 置于PCR仪中，20°C孵育15分钟。

④ 反应完成后，使用磁珠或PCR纯化柱进行产物纯化，去除接头二聚体和未连接接头。

4、注意事项

· 缓冲液（10× T4 DNA Ligase Buffer）在融解时如出现少量沉淀，属正常现象，请颠倒混匀后使用，不影响性能。

· 接头投入量是影响自连率和连接效率的核心变量——接头过多易产生大量Adapter Dimer，接头过少则连接效率不足。建议严格按接头用量参考表添加。

· 50% PEG6000 不可省略；若后续电转感受态，连接产物必须纯化。

FAQ

Q1：500 pg 微量 DNA 连接后文库产量低怎么办？

A1：接头摩尔比调至 400:1，酶添加 5 μL 上限；完整添加 PEG6000，可延长孵育至 20–30 min，磁珠分选保留短片段。

Q2：测序接头二聚体占比过高如何改善？

A2：减少接头添加量，严格遵循摩尔配比；反应结束后必须磁珠纯化去除游离接头。

Q3：是否兼容 Illumina 与 MGI 两种测序平台接头？

A3：完全兼容，针对 Y 型、泡状特殊接头均有稳定连接效果。

Q4：自动化预装室温放置半小时会不会失活？

A4：本品热稳定性经过优化，室温放置 30–60 min 后建库产量无明显衰减，适配批量自动化操作。

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