Case Studies小鼠T细胞激活实验方案

实验准备

完全培养基配方供参考：RPMI-1640（41402ES，终浓度90%）胎牛血清（终浓度40132ES，10%）丙酮酸钠（60171ES，终浓度1x）L-谷氨酰胺（60757ES，终浓度1x）HEPES（60117ES，终浓度1x）青霉素-链霉素（60162ES，终浓度1x）β-巯基乙醇（52644ES，终浓度55μM）

实验步骤-抗小鼠CD3单克隆抗体固定方法

1. 将NA/LE Rat anti-mouse CD3 Recombinant mAb稀释至PBS（41403ES）中，最终浓度为10µg/mL。

2. 将稀释后的NA/LE Rat anti-mouse CD3 Recombinant mAb按每孔1mL加入24孔板（84013ES）中固定。

2. 在37°C、5% CO₂条件下孵育2小时，或在4°C下孵育过夜。

4. 从24孔板中移除NA/LE Rat anti-mouse CD3 Recombinant mAb。

5. 准备小鼠脾脏的单细胞悬液。对于T细胞激活，细胞应重悬于完全培养基中，浓度为(1-3)×10⁶细胞/mL。对于24孔板，推荐浓度为1×10⁶细胞/mL。

6. 在V型管中准备完全补充的T细胞培养基，向步骤6中的细胞悬液中加入以下细胞因子和抗体：2µg/mL NA/LE Syrian Hamster anti-mouse CD28 mAb(92675ES)和10ng/mL IL-2 Protein, Mouse(92675ES)

7. 将所需量的细胞转移到合适的细胞培养板中，最终密度为(1-1.5)×10⁶细胞/mL/cm²。

8. 在37°C、5% CO₂条件下孵育2天。

9. 培养2天后，检查细胞的健康状况并记录图像。

10. 以400×g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。用PBS洗涤细胞沉淀。

11. 以400×g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。将细胞重悬于0.5mL 1%牛血清白蛋白（36101ES）中，计数细胞。检测细胞活性，要求活性>95%。

12. 用10µg小鼠IgG抗体(34102ES)阻断1×10⁶细胞。在冰浴中孵育30分钟。

13. 根据说明书加入FITC大鼠抗小鼠CD25抗体（S-R441）（S0B5215），在4°C下孵育30分钟。

14. 以400×g离心细胞悬液5分钟，用含1% BSA的PBS洗涤细胞沉淀两次。

15. 将细胞沉淀重悬于200µl PBS中，用于流式细胞术分析（需>104个细胞）。

实验案例

图1. 流式分析数据

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该套装共包含3种试剂：

重组小鼠IL-2细胞因子:为活化后的T细胞提供特异性增殖信号，有效促进T细胞规模化扩增，维持细胞生理活性与分化稳定性，避免活化后细胞凋亡、增殖停滞

抗小鼠CD28特异性抗体:提供关键共刺激信号，有效解除T细胞无能状态，持续激活下游NF-κB、MAPK等核心信号通路，促进T细胞活化、存活

抗小鼠CD3单克隆抗体:可持续、稳定结合T细胞表面TCR-CD3复合体，高效启动T细胞抗原识别核心信号通路，唤醒静息态T细胞，完成初始活化激活，信号刺激持久且均匀

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