技术讲解Protein A/G琼脂糖或磁珠-抗体捕获神器，轻松搞定IP/COIP！

——Protein A /G琼脂糖或磁珠

Protein A、Protein G是最常应用于抗体亲和纯化和免疫沉淀的蛋白。 Protein A/G琼脂糖或磁珠将Protein A、G共价偶联到介质表面，具有结合能力更强、结合范围更广、实用性更高的特点。

1、纯化抗体：一步纯化即可从血清或腹水样品中分离出高纯度的抗体。

2、免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）：通过对某蛋白质的富集，研究该蛋白的特性（如翻译后修饰等）。

3、免疫共沉淀Co-IP(co-Immunoprecipitation)：通过对某蛋白质的富集，研究与其结合的其他蛋白（即蛋白-蛋白相互作用、蛋白复合物等）。

1、Protein A/G 4FF Agarose纯化兔血清中的抗体。

图1 Protein A/G 4FF Agarose纯化抗体结果电泳图

2、Protein A/G4FF Agarose用于COIP: 针对p65和细胞周期蛋白依赖性激酶9（CDK9）的特异性抗体对提取的总细胞蛋白进行免疫沉淀分析。

Fig 2. Immunoprecipitants were then subjected to western blot analysis using specific antibodies against CDK9 and p65.

1、Co-IP背景较深或有杂带？

① 固相基质的非特异性结合，对琼脂糖微球做pre clear或者更换磁珠。

② 抗体结合非特异的蛋白，可设置对照排除非特异性条带。

③ 洗涤不当造成杂带，可优化缓冲液。

2、靶蛋白为什么没有条带？

① 没有添加抑制剂或裂解液不合适，导致蛋白构象改变不能结合或者降解。

② 饵蛋白较难洗脱，换成高强度的洗脱缓冲液。

③ 选用的抗体不合适，建议IP验证过的抗体，并优化下抗体用量。

④ 蛋白间为弱相互作用，或者相互作用依赖翻译后修饰。

3、Input条带清晰，Co-IP条带很弱？

① 饵蛋白X和靶蛋白Y的相互作用本身比较弱。

② 饵蛋白X并不是靶蛋白Y的唯一，只部分Y与X互作；可以尝试反向拉，比如用Y去拉X，可能效果比较好。

4、我的蛋白和抗体重链分子量很接近，怎样减少抗体干扰？

① IP/WB一抗使用不同种属来源，选择与IP抗体种属无交叉反应的二抗。

② 特殊二抗：比如仅识别重链或者轻链的二抗，或者仅识别天然抗体的二抗。

③ 直接源头遏制：将抗体交联到固相基质或protein A/G上，避免洗脱干扰。

5、琼脂糖难离心，容易吸上来一点，怎么办？

① 使用带滤膜的离心柱，下部有接样管，琼脂糖完全截留在滤膜上

② 换成磁珠

6、我的目的蛋白因为没有对应的特异性抗体而无法进行免疫沉淀，怎么办？

① 若此蛋白带标签，可选择针对此蛋白的标签抗体来进行免疫沉淀。

文献引用

[1] Wang X , Yu C , Wang C , et al. Novel cyclin-dependent kinase 9 (CDK9) inhibitor with suppression of cancer stemness activity against non-small-cell lung cancer[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2019, 181.IF: 5.201

[2] Zheng L, Xiang C, Li X, et al. STARD13-correlated ceRNA network-directed inhibition on YAP/TAZ activity suppresses stemness of breast cancer via co-regulating Hippo and Rho-GTPase/F-actin signaling[J]. Journal of hematology & oncology, 2018, 11(1): 72.IF：7.33

[3] Gao L, Guo Q, Li X, et al. MiR-873/PD-L1 axis regulates the stemness of breast cancer cells[J]. EBioMedicine, 2019, 41: 395-407. IF：6.68