Buying GuidesPCR替代方案！超全等温扩增RPA产品选择指南，助力现场快速检测！
重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是Piepenburg等人在2006年利用重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶等开发出的一种新的核酸恒温扩增技术。该技术能够在10~30 min内进行恒温（37~42℃）下的单分子核酸检测，它具有反应灵敏度高、特异性强、对仪器依赖程度低且可整合多种检
重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是Piepenburg等人在2006年利用重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶等开发出的一种新的核酸恒温扩增技术。该技术能够在10~30 min内进行恒温（37~42℃）下的单分子核酸检测，它具有反应灵敏度高、特异性强、对仪器依赖程度低且可整合多种检测模式等优点，特别适用于基层和现场即时检测，可广泛应用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域，有望成为聚合酶链式反应 (PCR) 替代方案。
RPA技术简介
RPA技术的原理是重组酶蛋白与引物（A）形成复合物，能在双链DNA中寻找同源序列（B）。然后通过重组酶（C）的链置换活性将引物插入同源位点，并且单链结合蛋白稳定置换DNA链（D）。随后重组酶被分解，使得引物的3'末端被链置换并与DNA聚合酶结合（E），使其延长引物（F），通过循环重复该过程对模板上的目标区域进行指数式扩增。
图1. RPA等温扩增技术原理图
RPA技术检测方法
基础型RPA检测方案，仅需在反应体系中加入一对特异性引物进行扩增，然后对扩增产物进行纯化，再进行琼脂糖凝胶电泳即可实现对检测结果的判读。
向基础型RPA反应体系中加入核酸外切酶Ⅲ(exonucleaseⅢ，exo)和exo荧光探针，或加入甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(formamide pyrimidine DNA glycosylase，fpg)和fpg荧光探针，用荧光定量仪来实时检测RPA反应。
1） exo探针法：在RPA的基础上，加入了核酸外切酶III（exonuclease III，即exo）和exo荧光探针，核酸外切酶III会特异地切割荧光探针（THF位点），荧光基团与淬灭基团分开，发出荧光信号，通过荧光收集的仪器来实时监控荧光值的变化。
图2. exo探针法检测原理图
2）fpg探针法：在RPA的基础上，加入甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶（fpg）及fpg荧光探针，当探针与模板结合时，fpg酶识别dR连接臂（dR group）并切割该位点，使得荧光基团与淬灭基团分开，发出荧光信号，通过荧光收集的仪器来实时监控荧光值的变化。
图3. fpg探针法检测原理图
在RPA的基础上，加入核酸外切酶Ⅳ（endonuclease Ⅳ，即nfo）、nfo探针和生物素标记的反向引物。当nfo探针与模板链互补时，核酸外切酶Ⅳ识别并切割THF残基位点，扩增获得既有探针标记物又有引物标记物的扩增子。然后加入对应的标记抗体，就能看到试纸条检测线上的结果条带。
图4. NFO探针法检测原理图
翌圣RPA体系核心原料
翌圣Zyme Editor™ 酶改造平台针对RPA技术，目前已获得RPA全系列性能优良的产品，包括链置换Bsu DNA polymerase、T4 UvsX Recombinase、T4 UvsY protein、T4 gene 32 protein、Exonuclease III等，搭配通用的扩增反应液，可满足不同用户对于各种检测体系的探索。同时，翌圣生物核心应用研发团队，经过缓冲液中各种离子配比的调试、酶的组合优化、多种辅因子添加等开发了适用于荧光型、层析型、电泳型三种方法进行核酸检测的常规液体型RPA预混液以及冻干粉形式，使用时只需加入特异性引物/探针、模板，30min左右即可完成检测，满足各种应用场景的快速检测需求。
电泳型RPA预混液部分数据展示
不同GC含量和片段长度扩增
图5. (A) 16727扩增不同GC含量靶标；（B）16727扩增不同长度靶标
使用16727ES依次扩增GC含量为40%-70%的靶标及长度100bp-500bp的靶标，阳性均能够出现明显、唯一的电泳条带，阴性均无明显条带，表明该产品对于不同GC含量及不同长度的靶标均能完成扩增。
稳定性测试
图6. (A) 16728正常保存稳定性测试；（B）16728冻融10次稳定性测试；（C）16728在37℃放置5天稳定性测试
考察16728的反复冻融和热加速稳定性，使用干冰将16728试剂反复冻融10次或者将16728在37℃条件下放置5天后，与正常保存的16728试剂，同时检测两个浓度靶标（P1-10 copies/μL,P2-2 copies/μL)，不同条件处理的16728试剂，两个浓度电泳条带明显、唯一，表明16728试剂稳定性良好。
灵敏度
图7. 16727和友商产品灵敏度比较
使用16727和市面上同类产品，同时检测竞品试剂盒中梯度稀释的阳性对照模板，检测结果显示，16727检测灵敏度更有优势。
翌圣RPA产品选择指南
产品大类 | 产品名称 | 产品货号 | 产品类型/作用 |
RPA Kit （液体型） | DNA Rapid Isothermal Amplification Kit（Fluorescent） | 16702ES | 荧光型RPA Kit（Exo探针法） |
RNA Rapid Isothermal Amplification Kit（Fluorescent） | 16708ES | 荧光型RT-RPA Kit（Exo探针法） | |
DNA Rapid Isothermal Amplification Kit（Chromatographi） | 16725ES | 层析型RPA Kit（Nfo探针法） | |
RNA Rapid Isothermal Amplification Kit（Chromatographi） | 16726ES | 层析型RT-RPA Kit（Nfo探针法） | |
DNA Rapid Isothermal Amplification Kit (Basic) | 16727ES | 电泳型RPA Kit | |
RNA Rapid Isothermal Amplification Kit (Basic) | 16728ES | 电泳型RT-RPAKit | |
RPA Kit （冻干粉） | DNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit（Fluorescent） | 16904ES | 荧光型RPA （Exo探针法）（原位冻干粉） |
RNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit（Fluorescent） | 16905ES | 荧光型RT-RPA（Exo探针法）（原位冻干粉） | |
DNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit（Chromatographi） | 16906ES | 层析型RPA （Nfo探针法）（原位冻干粉） | |
RNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit（Chromatographi） | 16907ES | 层析型RT-RPA（Nfo探针法）（原位冻干粉） | |
DNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit (Basic) | 16908ES | 电泳型RPA （原位冻干粉） | |
RNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit (Basic) | 16909ES | 电泳型RT-RPA （原位冻干粉） | |
单组份 | 11078ES | 结合引物与原始靶核酸序列互补合成新的DNA模板 | |
11079ES | 具有配对和链转移活性的重组酶 | ||
11080ES | 重组酶辅助因子，刺激T4 UvsX的单链DNA依赖性ATP酶活性并降低活性所需的T4 UvsX临界浓度 | ||
11081ES | 参与DNA复制、修复、重组与解链后的单链DNA结合，防止自杂交 | ||
14502ES | 刺激ATP和肌酸分解为磷酸肌酸和ADP，释放能量 | ||
14525ES | 具有3’→5’外切酶活性，切断荧光探针中淬灭基团，释放荧光 | ||
2× RPA Amplification Buffer | 16928ES | RPA通用buffer |
Not listed yet IMG RNA Rapid Isothermal Amplification Kit (...
Not listed yet IMG DNA Lyo Rapid Isothermal Amplification K...
Not listed yet IMG DNA Rapid Isothermal Amplification Kit (...
Not listed yet IMG RNA Rapid Isothermal Amplification Kit (...
Not listed yet IMG RNA Lyophilized Rapid Isothermal Amplifi...
Not listed yet IMG T4 Gene 32 Protein, gp 32 (5 μg/μL)
Not listed yet IMG Exonuclease III 核酸外切酶III (100 U/μL)
Not listed yet IMG Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/...
Not listed yet IMG Creatine Kinase (2 μg/μL)肌酸激酶
Not listed yet IMG T4 UvsX Recombinase T4 UvsX重组酶 (2 μg/μL)
Not listed yet IMG T4 UvsY protein T4 UvsY蛋白 (2 μg/μL)
Not listed yet IMG Endonuclease IV 核酸内切酶IV (10 U/μL)
Not listed yet IMG 2× RPA Amplification Buffer 通用型RPA Buffe...
Not listed yet IMG T4 gene 32 protein (gp 32) T4噬菌体基因32编码蛋白...
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