Case StudiesLAMP可冻干原料介绍
环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是 2000 年由 Notomi 等人开发的等温核酸扩增技术，核心是在60–65℃恒温下，用链置换 DNA 聚合酶和多对特异引物实现靶序列的高效、高特异性扩增，15–60 分钟可扩增至 10⁹–10¹⁰倍，无需热循环仪，非常适合现场快速检测。广泛应用于临
环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是 2000 年由 Notomi 等人开发的等温核酸扩增技术，核心是在60–65℃恒温下，用链置换 DNA 聚合酶和多对特异引物实现靶序列的高效、高特异性扩增，15–60 分钟可扩增至 10⁹–10¹⁰倍，无需热循环仪，非常适合现场快速检测。广泛应用于临床传染病诊断、环境监测、食品安全、病原检测等领域，尤其适配分子POCT平台。随着冻干技术的成熟化，LAMP冻干也被广泛关注，本文重点介绍LAMP在可冻干方向的原料，为相关检测产品研发和应用提供参考。
图 LAMP扩增原理
LAMP可冻干原料核心类别及特性
酶类是LAMP反应的核心动力，负责催化核酸链置换扩增，可冻干酶类需具备耐冻干性、常温稳定性和高效催化活性，常见类型包括以下两种：
1. Bst DNA聚合酶：作为LAMP反应的关键酶，具有链置换特性，无需高温变性即可启动核酸扩增，适配60-65℃等温反应条件。可冻干型Bst DNA聚合酶多为无甘油版本，如翌圣生物Bst DNA聚合酶冻干粉(60 U/μL，Glycerol-Free)，货号14405ES，与野生型Bst DNA Polymerase相比，该酶在扩增速度、产量、耐盐性和热稳定性等方面均有大幅提高，同时增加了dUTP耐受性，非常适合于等温扩增反应。冻干粉饼1年内无潮解，性能与液体试剂一致，阳性检出率达95%。
图 Bst DNA聚合酶冻干粉和冻干复溶液
2. 逆转录酶（RT）：针对RNA靶标检测的RT-LAMP技术，需搭配可冻干逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA后启动LAMP扩增，实现RNA的一步法检测。例如翌圣生物第三代耐热逆转录酶（无甘油版），货号11297ES，可耐受高达65℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。可扩增长达19.8kb的cDNA。
LAMP引物是保证反应特异性的核心，需根据靶标基因的6个独立区域设计，通常包括正向内引物（FIP）、反向内引物（BIP）、正向外引物（F3）、反向外引物（B3），部分场景可添加环引物（LF、LB）提升扩增效率。可冻干引物需满足以下特性：
1、纯度高（HPLC纯度≥98%），减少杂带干扰，确保扩增特异性；
2、耐冻干性，冻干过程中不会发生降解或构象变化，复融后可快速与靶标序列结合；
3、稳定性强，常温储运条件下可保存12个月以上，无需低温冷藏。
为避免引物与酶类在冻干过程中因空间距离过近导致引物二聚体产生、增加假阳性风险，部分可冻干原料采用引物与预混液分开冻干的方式，分别制成冻干微球，使用时同步复融即可，进一步提升检测准确性。
反应缓冲液为LAMP扩增提供适宜的反应环境，调节体系pH值、维持离子浓度，确保酶类活性和引物结合效率，可冻干缓冲液需经过配方优化，适配冻干工艺，核心组分及作用如下：
1. 基础缓冲体系：多采用Tris-HCl缓冲液，维持体系pH稳定在8.0-8.8，为酶类和引物提供适宜的酸碱环境；部分产品添加KOH调节pH，提升体系稳定性。
2. 离子组分：包含MgSO₄、KCl、(NH₄)₂SO₄等，其中Mg²⁺是Bst DNA聚合酶的激活剂，控制适宜浓度可提升酶活性，避免浓度过高或过低抑制反应；K⁺和NH₄⁺可调节核酸链的稳定性，促进引物结合和链置换扩增。
3. 辅助组分：添加Triton X-100等非离子表面活性剂，减少核酸吸附，提升扩增效率；部分缓冲液整合pH敏感指示剂（如酚红）或可视光染料，反应完成后可通过颜色变化肉眼判读结果，无需额外检测设备，适配现场快速检测场景。此外，dNTP（脱氧核苷三磷酸）作为扩增原料，需整合至缓冲液中，冻干后仍能维持其完整性，复融后为核酸合成提供原料。
冻干保护剂是LAMP可冻干原料的关键辅助成分，核心作用是在冻干过程中保护酶类、引物等活性组分，减少冰晶形成对其结构的破坏，确保冻干后活性保留，同时提升冻干产品的溶解性和常温稳定性。常见配方及组分如下：
1. 糖类保护剂：海藻糖、蔗糖是最常用的组分，可在活性组分表面形成保护膜，减少冻干过程中的脱水损伤，同时提升复融速度；甘露醇可改善冻干产品的外观，避免产品塌陷，提升稳定性。
2. 高分子保护剂：聚乙二醇（PEG 40000-70000）、乙烯基吡咯烷酮（PVP），可增强保护剂的粘性和稳定性，进一步保护酶类活性；牛血清蛋白（BSA）、苏氨酸也可作为辅助保护剂，提升酶类的耐冻干性和常温稳定性。
3. 其他辅助组分：叔丁醇可降低冻干过程中冰晶的形成速度，减少对活性组分的损伤；环糊精可改善保护剂的溶解性，提升冻干产品的复融效果。
翌圣生物开发的冻干保护剂（货号13743ES）整合海藻糖、PEG、甘露醇等成分，组成了一款全面的冻干保护剂，其辅助冻干，不影响检测试剂性能，适配多种可冻干试剂。
图 辅助液体版本可冻干RT-qPCR试剂，冻干后不影响其性能，且冻干粉热加速稳定。
随着分子诊断技术的不断发展，可冻干原料的配方持续优化，不仅在病原检测中广泛应用，还逐步拓展至肿瘤标志物检测、转基因产品检测等领域，未来将进一步提升原料的活性稳定性、检测灵敏度和适配性，推动LAMP技术在更多场景的普及应用。
翌圣生物部分冻干产品
类型 | 货号 | 名称 |
冻干保护剂 | 冻干保护剂V2 | |
UDG酶 | Uracil DNA Glycosylase (UDG), Heat-Labile (Glycerol-Free) | |
逆转录酶 | Hifair® III Reverse Transcriptase, 600 U/μL, Glycerol-free 第三代耐热逆转录酶（无甘油版） | |
Hifair UCF. ME® Advanced Reverse Transcriptase, Glycerol-free(200 U/μL) | ||
Hifair® V Reverse Transcriptase (600 U/μL, Glycerol-free) | ||
BST酶 | Lyophilized Bst Plus DNA Polymerase Bst DNA聚合酶冻干粉(60 U/μL，Glycerol-Free) | |
Hieff® Super Bst DNA Polymerase(2,000 U/μL) 耐高温（70℃）Bst DNA聚合酶(2,000 U/μL) | ||
Hieff® Bst Plus DNA Polymerase Bst DNA聚合酶 (40 U/μL) | ||
LAMP试剂 | RT-LAMP pH Sensitive Dye Chromogenic Version Freeze-Dryable Kit RT-LAMP试剂（PH指示剂法，可冻干） | |
RT-LAMP Lyo-Ready Fluorescent Assay Kit (Bst Plus) 二代RT-LAMP荧光染料法试剂（可冻干） |