Applications真菌DNA条形码的NGS应用：真菌宏条形码技术详解

一、背景介绍

1.1 真菌多样性认知的缺口

真菌是真菌生物圈中关键的分解者、共生者和病原体，但其多样性长期被严重低估。据估计，地球上存在约200万至300万种真菌，而目前仅约15.5万种得到正式描述和命名，大量“暗类群”（dark taxa）——即仅通过序列信息而被认知的物种——构成了真菌王国的绝大多数成员。传统形态学鉴定和培养方法存在显著局限性，无法有效应对隐种（cryptic species）鉴定、多重耐药菌监测及复杂环境样本分析等挑战。

真菌相关疾病对全球农业、医疗保健和生态系统稳定性构成日益严重的威胁。气候变迁进一步加剧病原体的传播和抗真菌药物的耐药性问题，迫切需要创新的管理策略。

1.2 DNA条形码与宏条形码的基本概念

DNA条形码（DNA barcoding） 是一种利用标准化的短DNA序列区域进行物种鉴定的分子技术。对于真菌而言，内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS）已被广泛接受为标准的真菌分子条形码。ITS区域位于核糖体DNA（rDNA）的18S与28S基因之间，包含ITS1、5.8S和ITS2三个亚区，具有较高的种间变异性和相对保守的种内稳定性。

宏条形码（metabarcoding） 是传统DNA条形码与高通量测序（High-Throughput Sequencing, HTS）技术的结合。该策略通过选择性扩增特定物种范围的物种特异性遗传标记（DNA宏条形码），并借助HTS技术探索其中的分类相关变异体，实现混合环境样本中微生物群落的快速、高通量鉴定。宏条形码技术突破了传统培养方法的局限，可在单次实验中解析环境样本中的数百种真菌。

1.3 ITS作为真菌标准条形码的确立

ITS区域之所以成为真菌条形码的 “金标准” ，主要得益于其高度的种间变异性和适中的片段长度。ITS序列的高种间变异性使其能够有效区分亲缘关系较近的物种，而片段长度（约250–800 bp）非常适合二代测序平台的要求。

然而，ITS的分辨率在Aspergillus和Fusarium等复杂属中仍存在交叉物种问题。在这些挑战性类群中，需要整合多基因位点策略（如β-tubulin、CaM、RPB1、RPB2、TEF1-α）以提升分辨率。例如，在埃及小麦赤霉病防控中，结合β-tubulin和calmodulin基因的多位点测序技术成功区分了Aspergillus carbonarius和A. niger等形态相似物种，使毒素检测准确率提升至99%。

1.4 NGS平台的演进

NGS平台的发展显著推动了真菌宏条形码研究的进展。Illumina平台以高通量和低成本优势在短读长宏条形码研究中占据主导地位；Oxford Nanopore Technologies（ONT）平台提供了长读长测序（>10 kb）和实时数据分析能力，适合现场快速检测和长片段扩增子测序；PacBio平台同样以长读长优势，在完整ITS/全长rRNA操纵子测序中获得广泛应用。这些平台共同实现了环境与临床样本中前所未有的真菌多样性高通量基因组学分析。

二、应用领域

2.1 临床诊断

真菌宏条形码技术在临床诊断中展现出重要价值。侵袭性真菌疾病（IFD），尤其是肺部真菌感染的发病率正在不断上升。免疫功能低下患者数量的增加——包括实体器官移植、造血干细胞移植、化疗接受者以及糖皮质激素和免疫抑制剂的使用——进一步加重了真菌感染的疾病负担。

传统培养方法对某些真菌（如毛霉菌目Mucorales和曲霉菌属Aspergillus）需要较长的培养时间，且显微镜检查难以有效区分这两类真菌，但它们的临床治疗方案却有显著差异。宏基因组NGS（mNGS）基于病原体核酸序列能够在两者之间实现准确区分，从而及时指导靶向抗真菌治疗。

全基因组测序帮助追踪Candida auris的跨国传播链，并通过解读ERG11基因突变谱指导个体化氟康唑剂量方案。基于纳米孔平台（GridION）的宏基因组三测序（mTGS）能够快速、灵敏、全面地检测病原体（包括培养方法漏检的真菌），为免疫功能低下患者的早期诊断和靶向治疗提供了重要补充诊断工具。

2.2 环境微生物组监测

宏条形码技术在环境真菌多样性研究中发挥着日益重要的作用。2023年巴西大豆锈病监测案例显示，基于ITS2的宏基因组测序不仅检测到致病菌Phakopsora pachyrhizi，还意外发现当地土壤中存在抗药性菌株的基因流动态，为精准施药提供了数据支持。

便携式纳米孔测序（MinION）在北极冻土样本分析中成功发现了Psychrotolerant酵母Rhodotorula frigidialcoholis的新代谢通路，为极地生态修复提供了生物技术方案。

2.3 植物病原体监测

真菌宏条形码技术在植物病原体快速鉴定中的应用发展迅速。一项针对链格孢属（Alternaria）的概念验证研究使用定制条形码引物——将靶向ITS1和ITS2区域（600 bp）的通用引物与ONT条形码序列相结合——在感染的葡萄、柑橘、崖柏和枫树样本中成功鉴定了链格孢属及其他相关真菌群落。

该工作流程显著缩短了实验操作时间和成本，未来将进一步优化以实现96份样本的高通量测序和大型真菌组分析的适用性验证。

2.4 土壤和食物样本分析

土壤、粪便、腐烂木材等环境样本中的真菌群落分析是宏条形码技术的重要应用场景。基于ITS2标记物的高测序扩增子方案已成功用于腐殖质丰富的土壤、木材和凋落物中的总真菌群落研究。在绵羊胃肠道线虫研究中，研究人员开发了基于ONT技术的ITS-1/5.8S/ITS-2长读长宏条形码方法，并设计了可最大限度减少粪便真菌序列脱靶扩增的新引物对EC1/EC2。

三、常用引物及引物序列

3.1 真菌通用ITS引物

以下为真菌宏条形码中最常用的ITS引物及其序列

3.2 宏条形码优化的引物组合

针对高通量测序平台的特定需求，已开发出多种优化的宏条形码引物组合：

注：ITS1F-KYO2正向引物序列为TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC，ITS2-KYO2反向引物为简化设计，旨在减少宿主DNA的共扩增效应。针对宏条形码环境样本分析，ITS1bc（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS2bc（5′-GCTRCGYTCTTCATCGATGC-3′）方案可有效降低植物DNA污染导致的误判。

3.3 条形码索引化引物设计

在样本复用测序中，需要将条形码（barcode）序列整合到引物设计中。基本的建库策略包括两类：

• 两步PCR法（如Illumina Fungal Metagenomics workflow） ：第一轮PCR扩增ITS目标区域，第二轮PCR添加索引序列（index）和测序接头。其核心步骤包括：

第一轮：使用ITS1f/ITS2真菌特异性引物扩增样本

第二轮：通过索引引物添加Illumina接头和样本特异性的双端索引

最终PCR产物纯化后等摩尔混合进行测序

• 单步条形码引物法（如ONT barcoded primers方法） ：在引物5‘端直接偶联条形码序列和测序接头，通过单轮PCR完成扩增子建库。这种方法减少了实验操作时间和污染风险，成本更低。

3.4 不同平台的引物选择考量

引物选择需根据具体研究目标、样本类型和测序平台进行权衡：

• ITS1 vs ITS2：靶向ITS1区域的引物组合通常比ITS2区域具有更高的真菌特异性，二者在分类覆盖率上相当。但ITS1长度较短，更适用于高度降解的环境DNA样本。
• 短读长平台（Illumina MiSeq/HiSeq） ：推荐使用ITS1f-ITS2引物组合（~250–600 bp的PCR产物），适配250 bp 配对末双端测序。
• 长读长平台（ONT MinION/GridION, PacBio Sequel/Revio） ：推荐使用ITS1F-ITS4或ITS9munngs-ITS4ngsUni引物组合，可获得约600–900 bp的全长ITS序列，甚至直接扩增完整的rRNA操纵子（ETS-SSU-ITS1-5.8S-ITS2-LSU-IGS），以实现更精细的物种分辨率

四、植物DNA宏条形码实验步骤

样本类型：土壤、植物组织、空气孢子、粪便、临床标本等。

关键要点：

使用无菌器具采样，避免交叉污染

代表性采样：每份样本收集多份子样合并为一个代表性样本

现场快速处理或立即冷冻（-80℃）保存，必要时使用RNAlater、无水乙醇等保存液

对于空气孢子等低生物量样本，需使用无菌滤膜（如0.22 μm或0.45 μm）过滤采集

常规实验步骤如下：

1. 样品采集与DNA提取

样品采集：根据研究目的，采集代表性环境样品（如2L水样、10g土壤）。使用无菌容器，避免交叉污染，每个样品独立采集。

DNA提取：使用商用试剂盒（如MolPure® Mag Plant DNA Kit（18529ES，植物通用DNA提取）或MolPure® Mag Soil/Stool DNA Kit（18526ES磁珠法土壤/粪便DNA提取试剂盒）），严格按照说明书提取总DNA，并测定DNA浓度和质量（OD260/280在1.8–2.0之间为佳）。

DNA浓度测定：使用qubit定量设备（单通道核酸定量仪80571ES、83509ES，96通道核酸定量仪80575ES、83652ES）搭配qubit试剂（12642ES）测定浓度。

2. 目标片段富集：PCR扩增（注，不同测序平台，扩增引物会有差异）

设置PCR反应：50 μL PCR体系中包括以下成分：

配置好以上体系后，在PCR仪中设置以下PCR程序：

3. 扩增产物0.9×纯化

1) 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads（12601ES）磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min，配制80%乙醇。

2) 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3) 吸取 45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一轮PCR产物中，室温孵育5 min。

4) 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约 5 min），小心移除上清。

5) 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec后，小心移除上清。

6) 重复步骤5，总计漂洗两次。

7) 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5min）。

8) 直接加入11 μL ddH2O，将PCR 管从磁力架中取出，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。进入下一步反应。

4. 电泳检测：取1 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳（10208ES），确认目标条带明亮清晰，无非特异性扩增。

5-1 选择二代测序时：二次PCR（添加样品标签与测序接头）

二次PCR加标签：以纯化后的一次PCR产物为模板，使用带Illumina或者MGI接头的引物进行二次PCR扩增（13344ES），为每个样品添加独特的index标签，以便混合测序后区分不同样品。

纯化二次PCR产物：再次使用磁珠法纯化加标签后的文库产物（12601ES）。

5-2. 选择三代测序时：直接搭配通用建库试剂即可完成三代文库构建（13306ES）。

建库完成后，对文库进行纯化以便后续上机测序（12601ES）。。

6. 文库定量、混合与测序

浓度检测：使用qubit定量设备（单通道核酸定量仪80571ES、83509ES，96通道核酸定量仪80575ES、83652ES）搭配qubit试剂（12642ES）测定浓度。

等摩尔混合：将所有样品文库按等摩尔浓度混合，形成最终的测序pool。

高通量测序：将混合文库送检至NGS平台，常用平台包括Illumina NovaSeq、MGI T7或ONT、Cyclone等测序仪。

7. 生物信息学分析

五、挑战与未来展望

尽管真菌宏条形码技术已取得了显著进展，仍面临若干挑战：

• 数据库误差：现有真菌参考数据库中仍存在分类标注错误和序列偏差，影响物种注释的准确性。
• 引物偏倚：不同引物组合对真菌类群的扩增效率存在差异，可能导致群落组成的人为偏差。
• 标准化不足：实验和分析流程尚缺乏统一标准，不利于跨研究间的比较和整合。
• 基因组内变异：rRNA的多拷贝性在真菌基因组中普遍存在，可能导致种内序列变异被误判为新物种。

未来的发展方向包括：

• 多组学与机器学习的整合：结合宏转录组学、宏蛋白质组学和代谢组学，以及机器学习算法进行抗真菌耐药性预测和宿主-病原体互作分析。
• 单倍型分辨率的宏条形码：长读长平台有助于区分单倍型间的细微差异，从根本上解决基因组内变异的干扰问题。
• 实时便携式测序：纳米孔测序仪（MinION）与田间采样相结合，实现即时病原监测和风险评估。
• CRISPR-Cas技术与等温扩增的深度融合：开发超灵敏、低成本的现场即时检测体系。例如，田间技术人员可在CARRIE等便携设备上15分钟内完成10个孢子/克水平的病原鉴定。

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