应用方向DNA文库制备 | 水稻\小麦\大豆\玉米\甘蔗植物育种样本全基因组测序
实验所用试剂清单类别货号产品名称DNA 建库12972ESHieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4 一步法DNA酶切建库试剂盒V4磁珠12601ESHieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠定量12642ES
实验所用试剂清单
类别 | 货号 | 产品名称 |
DNA 建库 | Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4 一步法DNA酶切建库试剂盒V4 | |
磁珠 | Hieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠 | |
定量 | 1× dsDNA HS Assay Kit 即用型dsDNA qubit定量试剂 | |
接头 | Hieff NGS® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI®, Set3（系列一：384种MGI平台接头，双端唯一短接头，Set3） | |
自备材料 | — | 无水乙醇 |
实验前准备
1、磁珠使用前应先平衡至室温；
2、配制80%乙醇
3、接头2倍稀释。
4、按照下表中的量准备样本。
实验编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
物种 | 小麦叶 | 水稻叶 | 水稻种子 | 大豆种子 | 玉米种子 | 甘蔗叶 |
实验条件
建库方式 | 手动操作 |
input | 200ng |
片段化 | 4℃ 1min，30℃ 15 min，72℃ 20min，4℃ hold |
Adapter | MGI 短接头，2倍稀释 |
连接后纯化、分选比例 | 连接后0.8×纯化、 分选0.6×/0.2× |
扩增循环数 | 7 cycles |
扩增后纯化比例 | 0.9×纯化 |
文库洗脱 | 40 μL |
操作步骤
一、DNA片段化/末端修复/dA尾添加 (DNA Fragmentation/End Repair/dA-Tailing)
将表1各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。于冰上配制表1反应体系，使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。参考表格反应程序，进行DNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。
表1.DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应
反应体系 | 反应程序 | ||
名称 | 体积(μL) | 温度 | 时间 |
Input DNA | 200 ng | 热盖105℃ | On |
Smearase®Buffer 4.0 | 10 | 4℃ | 1 min |
Smearase®Enzyme 4.0 | 10 | 30℃ | 15min |
ddH2O | Up to 60 | 72℃ | 20 min |
- | - | 4℃ | Hold |
二、接头连接 (Adapter Ligation)
需要根据Input DNA量稀释Adapter至合适浓度，本次使用的UDI接头稀释2倍。
将表2中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。于冰上配制表1反应体系，使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。参考表2设置反应程序，进行接头连接反应。
表2.接头连接反应
名称 | 体积(μL) | 温度 | 时间 |
dA-tailed DNA | 60 | - | - |
Ligation Enhancer4.0 | 30* | 热盖 | Off |
RapidDNA Ligase4.0 | 10 | 20℃ | 15 min |
PEAdapter | 5 | 4℃ | Hold |
ddH2O | Up to 110 | - | - |
【注】：*LigationEnhancer比较粘稠，使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。
三、连接产物磁珠纯化(Post Ligation Clean Up)
该步骤使用磁珠对接头连接产物进行纯化。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。
本次采用接头连接后先纯化再分选方案，连接产物先进行0.8×纯化，102 μL ddH2O洗脱后再按0.6×/0.2×比例分选，最终洗脱产物20 μL进行下一步扩增反应。
三、文库扩增(Library Amplification)
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。参考表3进行文库扩增反应体系配制和程序设置。
表3.文库扩增反应
名称 | 体积(μL) | 温度 | 时间 | 循环数 |
Adapter Ligated DNA | 20 | 98℃ | 45sec | 1 |
2×Ultima HF Amplification Mix | 25 | 98℃ |
| 7 |
Primer Mix（12330ES） | 5* | 60℃ | 30 sec | |
Total | 50 | 72℃ | 30 sec | |
- | - | 72℃ | 1min | 1 |
- | - | 4℃ | Hold | - |
四、扩增产物磁珠纯化
扩增后产物使用Hieff NGS®DNA Selection Beads (0.9×，Beads:DNA=0.9:1)纯化。
质检结果
实验编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
样本 | 小麦叶 | 水稻叶 | 水稻种子 | 大豆种子 | 玉米种子 | 甘蔗叶 | |
洗脱ng/μL（40μL洗脱） | 56.6 | 64.6 | 55.2 | 48.4 | 39.8 | 37.4 | |
文库产量 | 2264 | 2584 | 2208 | 1936 | 1592 | 1496 |
文库琼脂糖凝胶电泳图（Marker 最亮的条带为500 bp）
实验结果分析
植物育种样本，水稻小麦大豆玉米甘蔗采用酶切法建库试剂盒12972ES建库，文库产量高，文库片段集中，满足质控标准。