Applications表观专题：你的CUT&tag加spike in了吗

组蛋白作为染色体结构的核心组分，在基因表达的影响方面作用较大，而其中影响最大的是组蛋白修饰的改变。而组蛋白修饰作为表观组学重要研究内容之一，主要是通过不同的组蛋白修饰形成异染色质或者常染色质状态，从而使得基因的表达呈现关闭或开放的状态。

图：组蛋白修饰的表观调控

组蛋白可以发生各种各样的修饰，像甲基化修饰、乙酰化修饰、磷酸化修饰、泛素化修饰等，而目前在组学研究中，研究最为透彻的是H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3、H3K27ac、H3K36me3。不同的组蛋白修饰有不同的功能，同时在基因组上的位置分布也不同。常见的处于异染色质区域作为基因沉默的marker的有H3K9me3、H3K27me3和H4K20me3，而处于常染色质区域作为基因激活marker的有H3K4me3、H3K36me3和H3K79me3。

图：染色体结构图

图：不同组蛋白修饰在基因组中的位置分布

作为DNA-蛋白互作尤其是组蛋白修饰研究的新兴技术，CUT&tag的出现引发了一波表观热潮。尤其是其属于细胞内的原位实验，相较于ChIP-seq来说，优势明显。CUT&tag实验无需甲醛交联（对于一些结合较弱的转录因子，可以进行轻微甲醛交联）和超声片段化，这无疑降低了实验的门槛。同时，CUT&tag实验中，Tn5酶的应用使得一步法建库成为可能。该实验仍然利用了Tn5酶的特性，在转座切割时，原位切割的DNA上会携带Tn5酶的核心序列。进行文库构建步骤时，含有Tn5酶核心序列的接头能够直接连接和扩增就能将目的蛋白特异性抗体靶向结合DNA序列直接扩增成文库，无需繁琐的末修、加A和接头连接等步骤。更重要的是，Tn5酶的使用，使得CUT&Tag能较好的应用在高通量单细胞表观研究中。目前已经有成熟的偶联含Tn5酶核心序列的Gel beads投入使用，我们进行常规CUT&tag实验后，进行单细胞捕获环节，gel beads上的核心序列会与细胞内特异性酶切DNA进行偶联，最后，通过常规的Tn5酶切建库的方式进行文库扩增，扩增后的序列会携带barcode进行细胞标记，从而实现单细胞CUT&tag研究。

图：scCUT&tag实验流程，from Steven J. W. et al, 2021, Nature Biotechnology

在DNA-蛋白互作技术研究中，spike in的添加一直是一大传统。当然了，spike in的添加不仅仅只在DNA-蛋白互作技术研究中被应用，常见的如RNA-seq中，也有大量报道进行了spike in的添加。Spike in可以对样本中真实基因的表达进行校正，同时也能作为恒量实验好坏的质控标准。

图：spike in的优势，From K.C et al. 2016

作为DNA-蛋白互作技术研究的金标准和老大哥，ChIP-seq实验中主要是添加外源的果蝇基因组用于spike in。而spike in的添加，能让之前因PCR循环或测序偏好性影响而未检测到的表达差异的基因在spike in normalization后，显示出表达差异。

图：ChIP-seq实验中spike in添加的优势

除了ChIP-seq外，CUT&RUN技术在研发报道时期，也是有spike in的添加。CUT&RUN进行DNA-蛋白互作研究时，已所需样本数较低引起轰动，而spike in的添加，使得不同样本投入量得结果显示更真实，因为细胞投入量更低，在特异抗体靶向捕获时，获得的reads数也会更低。传统数据分析无法体现细胞低投入，而加入spike in后，不同细胞投入数，特异性捕获的DNA reads数也不同。

图：CUT&RUN实验中加入spike in优势

翌圣生物创造性的在CUT&tag实验中，传承了spike in的优势，在CUT&tag实验中，加入三段不同长度的lamda DNA组成spikein mix，恒量spike in的加入，让你的qPCR结果不受投入量影响，定量更准确。

图：CUT&Tag实验中加入spike in

Spike in加入后，进行文库构建，建库前spikein-1：spikein-2：spikein-3=1：3：10，文库构建后，比例变化不大。对建库前的spike in和建库后的spike in进行回归方程计算，发现建库前和建库后的spike in呈现线性变化，R的平方值都达到0.99以上，表明spike in的加入，可以让建库后的DNA能够进行定量，且能定量回溯到建库前DNA的含量。

说了这么多，spike in的优势你get到了么？

那么，你的CUT&tag实验中加spike in了吗？

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