News干货 | CRISPR技术引领谱系追踪新时代，助力科研突破！

谱系追踪技术犹如一把解锁生命奥秘的“时光机”，通过为每个细胞赋予独特的“条形码”，记录并分析这些信息，构建出细胞家族的“族谱”——细胞谱系树。该技术能够追溯生物体内每个细胞的起源与分化历程，揭示细胞从胚胎发育到成熟个体的动态演变过程。这项技术不仅清晰展现了细胞间的亲缘关系，还记录了它们在时间和空间上的动态变化，为深入理解发育、疾病和再生等生命过程提供了关键线索，其应用场景包括发育生物学、肿瘤研究、免疫学和再生医学等。随着单细胞测序等高新技术的不断发展，目前常见的谱系追踪技术主要有如下几种：

表1.常见谱系追踪技术原理及特点

近日，中国科学院广州生物医药与健康研究院彭广敦研究团队的最新突破，为谱系追踪技术注入了新的活力。该团队成功开发出新型单细胞谱系示踪技术——DuTracer。该技术创新性地结合了CRISPR-Cas9和Cas12a两种基因编辑工具，显著提升了细胞谱系追踪的精度和深度^[3]。传统的细胞谱系追踪方法，因技术限制致使信息记录不全，而基于CRISPR的基因编辑技术提高了分辨率，却存在靶点间大片段删除难题，如同在记录家族历史时丢失关键代际信息。DuTracer的创新之处在于同时利用Cas9和Cas12a两种核酸酶，并通过控制它们的激活时间，避免多靶点同时编辑引发的示踪信息丢失。实验显示，该技术在小鼠胚胎干细胞和类器官模型中大幅降低了有害删除事件，且记录的细胞分裂层级更深，能够更精准地还原细胞分化路径。

图1.DuTracer设计原理

接下来，小编将为大家重点推荐几款明星产品，助您轻松开启科研探索之旅！

Cas9 Nuclease来源于野生型酿脓链球菌S. pyogenes，是依赖RNA介导的内切核酸酶，可以特异地切割双链DNA（在DNA PAM存在的情况下，也可以切割单链DNA或单链RNA）。Cas9切割位点位于目标序列内，离PAM（NGG）区3个碱基。本产品经过密码子优化及核定位信号（NLS）设计，由大肠杆菌重组表达而来，编辑效率高，可用于细胞（造血干细胞、T细胞等）的基因修饰，也可用于分子诊断，检测病原体等。

A：体外切割测试：3批次体外切割活性均达98%以上；

B：体内基因敲除，敲除效率与进口品牌一致。

图2.Cas9 Nuclease体外切割活性及基因敲除效率结果

ArCas12a核酸内切酶，源自Agathobacter rectalis细菌的CRISPR系统，别名Cpf1，是一个包含1263个氨基酸的单体蛋白。Cas12a缺乏HNH结构域，可单独利用其RuvC结构域在CRISPR RNA（crRNA）引导下识别位于靶标核酸5’端富含胸腺嘧啶（T）的PAM区而启动对靶标DNA的切割，已成功用于许多哺乳动物和植物的基因组编辑。此外Cas12a还具有反式切割活性，可不加选择地切割反应体系中的非靶标单链DNA。与LbCas12a/AsCas12a相比，ArCas12a具有更高的温度适应性（25-55℃），可适用于基因组编辑及核酸检测等。

图3.ArCas12a顺式切割活性检测 M：Marker；C：模板双链DNA

注：在crRNA的引导下可高效的切割双链DNA（600 bp）产生两段切割产物（200 bp+400 bp）

图4.ArCas12a反式切割活性检测

注：以双链DNA模板为靶标，加入ArCas12a、crRNA（存在与模板DNA序列互补的spacer区）及单链DNA报告探针（含有荧光报告基团）进行体外切割，当ArCas12a与crRNA及靶标DNA形成复合体后会激活反式切割活性，切割单链DNA报告探针，从而发出荧光。结果显示，翌圣ArCas12a与crRNA及模板DNA形成复合体后具有反式切割活性，可剪切单链DNA。

AapCas12b核酸酶（又名C2c1）是由tracrRNA:crRNA（或sgRNA）介导的DNA核酸内切酶，来源于嗜酸耐热菌Alicyclobacillus acidophilus，在靶标双链DNA存在PAM（TTN）序列的情况下，特异地剪切靶标双链DNA，使DNA双链断裂并生成粘性末端。AapCas12b可不依赖PAM序列特异地剪切单链DNA靶标。双链或单链DNA靶标均能激活AapCas12b的反式剪切活性（即旁路剪切活性/附属剪切活性），即当AapCas12b酶与sgRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，便会被激活针对非特异序列ssDNA的反式剪切活性，将体系中的任意序列ssDNA切碎。AapCas12b最佳剪切反应温度为60℃，比AacCas12b更耐高温，适用于与LAMP联用，开发恒温扩增/CRISPR-Cas检测体系。

图5.AapCas12b Nuclease (10 μM)顺式切割活性验证

注：在20 μL的反应体系，含有带PMA序列的双链Target DNA、sgRNA、Cas12b和1×reaction buffer，在60°C下反应30 min，85°C下灭活5 min，在琼脂糖凝胶电泳测定结果显示，三批次AapCas12b Nuclease (10 μM) (Cat#14808ES)均能有效切割双链Target DNA,切割效果与进口品牌T*相当。

图6.AapCas12b Nuclease (10 μM)反式切割活性验证

注：在20 μL的反应体系，含有带PMA序列的双链Target DNA、sgRNA、Cas12b、Report ssDNA荧光探针和1×reaction buffer，在60℃反应1h，每30 sec采集一次荧光信号，结果显示在Target DNA、sgRNA、Cas12b共同存在的情况下，Report ssDNA荧光探针能被切割，从而释放荧光信号。

该试剂盒的应用极为简便，用户只需设计一条特定的上游引物，并结合试剂盒提供的其他试剂，即可在短短4小时内合成出20-100 μg高品质的sgRNA。所产生的sgRNA具备高产量、高纯度和高活性等优势，在基因编辑过程中能显著提升编辑效率，并大幅降低脱靶现象的发生几率，确保基因编辑工作以高效率和高准确性进行。

图7.不同时间的sgRNA的合成量

图8.不同序列的sgRNA的合成产量

图9.合成的sgRNA的纯度（安捷伦2100测定）

图10.sgRNA的剪切效率效果图

当前，CRISPR基因编辑技术正处于快速发展的时期，整个领域仍在不断成熟和完善中。随着科学研究和技术应用的持续推进，我们有理由相信未来将涌现出更多创新性的基因编辑工具，这些新工具将进一步拓宽该技术的应用场景与潜力。

如果您对基因编辑有任何需求或兴趣，欢迎随时联系我们。无论是在基础研究、药物开发、农业生物技术、合成生物学等领域，我们都致力于为您提供最前沿的技术支持和服务，共同探索基因编辑带来的无限可能。

参考文献：

[1] Kretzschmar K, Watt F M. Lineage tracing[J]. Cell, 2012, 148(1): 33-45.

[2] Hsu Y C. Theory and practice of lineage tracing[J]. Stem Cells, 2015, 33(11): 3197-3204.

[3] Chen C, Liao Y, Zhu M, et al. Dual-nuclease single-cell lineage tracing by Cas9 and Cas12a[J]. Cell Reports, 2025, 44(1).