技术讲解cfDNA 甲基化建库必看！单链 vs 双链方法大比拼

摘要：一文读懂cfDNA 单链与双链甲基化建库的核心差异

背景

ucfDNA 是血浆中游离的 DNA 片段，反映细胞更新状态，其甲基化测序可解析组织来源（TOO）、染色质结构等关键信息，是液体活检的重要技术手段。

ucfDNA 存在非随机片段化特征：核小体保护区域免受核酸酶降解，且该区域甲基化水平显著高于开放染色质，因此 cfDNA 整体甲基化水平高于基因组 DNA。

udsDNA 建库需通过酶促末端修复将cfDNA 的不规则末端补平为平末端，此过程会引入新合成的未甲基化核苷酸，可能降低片段末端的 CpG 甲基化水平；而 ssDNA 建库省略该步骤，可直接连接接头并保留天然末端特征。

二、技术路线

样本制备

从全血中提取血浆cfDNA，使用 Qubit 荧光计和 Agilent TapeStation 进行定量和片段大小检测。(推荐翌圣生物cat#18382ES)以1 ngcfDNA 为起始量，分别构建两种文库：dsDNA 文库构建(推荐翌圣生物cat#12214ES)，ssDNA 文库构建(推荐翌圣生物cat#12221ES)，均扩增11 个循环。

测序与数据处理

1. 文库在Illumina NextSeq® 2000 测序，采用 2×66 bp 读长；通过 SeqPrep2、bwa-meth、Picard 等工具完成接头修剪、序列比对、重复序列标记。

2. 用MethylDackel 提取 CpG 位点甲基化信息，设置最小测序深度、最小比对质量、20为筛选阈值。

核小体相关甲基化分析

基于NucPosDB 的核小体图谱，将其调整为 1 bp 中点分辨率，用 bedtools 计算 CpG 位点到核小体中心的距离，分析甲基化与核小体位置的关联。

组织来源（TOO）推断

1. 采用Loyfer 等的人正常细胞甲基化图谱（GSE186458），选取 13 种 cfDNA 相关组织（如血管内皮、粒细胞、肝细胞等）作为参考。

2. 用非负最小二乘法（NNLS）进行TOO 推断，按70% 训练 / 30% 测试进行100 次随机迭代，以决定系数（R²）和均方误差（MSE）评估推断效果。

末端修剪校正实验

对dsDNA 测序读段分别修剪20 bp和40 bp，重新分析甲基化水平和TOO 推断效果，对比不同修剪长度的校正作用。

三、结果分析

本研究通过两个cfDNA 提取物的配对文库验证，得到以下关键结果，核心文库基础数据见下表：

表1 两种建库方法的文库基础特征

图1 GC位点甲基化水平

结果显示

dsDNA 文库存在显著的甲基化分布偏差

ØdsDNA 文库的 CpG 甲基化水平从读段~40 bp开始逐步下降，反向模板读段3' 端出现急剧的甲基化丢失；而 ssDNA 文库在整个读段中保持均匀的甲基化水平。

Ø核小体层面：dsDNA 文库在核小体二联体下游出现链特异性的低甲基化，与末端修复补平 5' 突出端引入未甲基化胞嘧啶的机制一致；ssDNA 文库则在核小体二联体两侧呈对称的甲基化分布。

dsDNA 文库全局甲基化水平显著降低

Ø末端修复导致dsDNA 文库在核小体相控区域的全局CpG 甲基化水平降低约 5–7%，该偏差叠加在核小体核心区固有的甲基化低谷之上。

dsDNA 文库降低 TOO 推断的准确性

ØdsDNA 文库因引入未甲基化胞嘧啶，高甲基化 CpG 位点的占比被低估，部分甲基化位点的丰度异常升高；而 ssDNA 文库能保留核小体保护区域的高甲基化特征，更贴合 cfDNA 原生状态。

ØTOO 推断中，ssDNA 文库在高信息度CpG 子集（甲基化率<0.2 或> 0.8、<0.1 或 > 0.9）中始终表现出更高的R²和更低的MSE；而无生物学信息的未甲基化对照CpG 位点，两种文库的推断效果无显著差异。

读段末端修剪可部分校正甲基化偏差，但存在权衡

Ø对dsDNA 读段进行 20/40 bp 末端修剪后，甲基化水平向 ssDNA 文库趋近，TOO 推断的 R² 提升、MSE 降低，40 bp 修剪可基本恢复 dsDNA 甲基化的保真度（需将ssDNA 数据降采样至相同深度）。

Ø修剪的弊端：显著降低独特测序覆盖度，并丢失片段末端坐标，导致片段组学分析的关键信息缺失。

四、总结

ØdsDNA 甲基化双链建库中的酶促末端修复步骤是导致cfDNA 甲基化水平低估的关键因素。

ØssDNA 甲基化单链建库因省略末端修复步骤，能保留cfDNA 的天然末端特征和甲基化图谱，更准确地反映原生 cfDNA 的生化状态，是 cfDNA 甲基化测序分析的更优选择。

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参考文献

[ 1] GROTH T E, MISHIN A A, RAO V, et al. End-repair causes methylation underestimation in cell-free DNA sequencing libraries[EB/OL]. bioRxiv Preprint, 2025[2025-12-17]. https://doi.org/10.64898/2025.12.15.694439.