应用案例BCECF,AM检测活细胞pH的Protocol

背景介绍

正常细胞内 pH（6.8-7.4）在细胞的生理活动中起着至关重要的作用，是细胞内酶活性和生理功能的重要决定因素，细胞内的酸化作用与细胞凋亡有着很大的关联，细胞凋亡或者病变的发生通常伴随着细胞内pH的下降。

产品简介

亲脂性的BCECF-AM（Cat#40701ES）其本身不发荧光，但其可以轻易地穿过细胞膜进入到细胞内，当AM基团经酯酶水解成为亲水性的荧光指示剂BCECF，在pH值适宜时会发出明亮的绿色荧光。

使用激光共聚焦显微镜或者荧光酶标仪等特定的仪器，可以测得 绿色荧光的强度，再结合pH标准液可以绘制标准曲线，就能够计算出目标细胞内的pH值。

BCECF-AM 可用于测量多种组织细胞的pH值，包括各种动物、植物的组织细胞以及细菌和酵母等。

图1、随着pH的降低，荧光强度也随之降低

检测操作

一、检测前准备：

①pH标准液（可自行配置，也可订购成品），pH范围推荐5.0-8.5

②Nigericin 尼日利亚霉素（用于搭配pH标准液，Cat#722905ES）

③细胞（如Hela等）

④共聚焦显微镜/全波长荧光酶标仪

⑤35 mm共聚焦皿（Cat#84006ES/84007ES）/96孔黑色细胞培养板（Cat#83652ES）

其它试剂：无水DMSO（Cat#60313ES）、PBS 缓冲液（Cat#41404ES）/HBSS缓冲液（Cat#60148ES）、培养基、FBS（Cat#40132ES）等

注：检测Ex/Em=490 nm/530 nm(激发/发射） 、Ex/Em=440 nm/530 nm（激发/发射）【双参数，激光共聚焦检测时需同时开启双通道】

图2、随着pH的升高，荧光强度也随之增强

附 pH标准品配置

使用HCl或KOH调整pH为5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0,8.5制备成pH标准液。

二、BCECF，AM探针孵育

①接种细胞

将Hela细胞（10^5个细胞）接种于35 mm的共聚焦小皿中，待细胞密度为40%时进行染色。

②探针的孵育

使用HBSS缓冲液清洗细胞，向每个小皿中加入2 mL BCECF, AM工作液，BCECF工作浓度为1-10 μM，避光孵育30 min。

注：使用无水DMSO溶解BCECF, AM配置为储存液，储存液浓度推荐1-10 mM；使用HBSS缓冲液对BCECF, AM储存液进行稀释，工作液中DMSO含量不高于0.1%。

③加入pH标准液进行荧光检测

完成孵育后弃掉工作液，使用pH标准液进行清洗，向不同皿中分别加入5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5标准液孵育10 min（待测pH细胞样本中不需加pH标准液）。

开启双通道，设置两组激发/发射波长Ex/Em=490 nm/530 nm及Ex/Em=440 nm/530 nm进行成像，每个皿不少于2×3张（每组参数不少于3张）。

④标准曲线绘制及计算

统计490/530及440/530每组的平均荧光强度，计算F490/F440（Ratio）。以pH为横坐标，以Ratio为纵坐标，绘制S型（sigmoidal）标准曲线，根据公式代入待测细胞样本的荧光比值ratio计算出细胞pH值。

如下为典型的S型标准曲线及公式：

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