Buying Guides微生物培养——大肠杆菌的培养与分离实验指南

微生物是一类个体微小、结构简单、需借助显微镜观测的生物统称，涵盖细菌、真菌、病毒等类群，具有繁殖快、代谢类型多样、适应能力强的特征。微生物培养是通过人工调控营养、温度、pH等条件，实现目标菌株生长繁殖的核心技术，广泛应用于生物医药（疫苗、重组蛋白生产）、工业发酵（食品、酶制剂制备）、农业（生物肥、生物农药研发）、环境治理（污水、土壤修复）及生命科学研究领域，为技术转化与产业升级提供关键支撑。大肠杆菌（Escherichia coli）因繁殖迅速、遗传背景清晰、培养条件简便，成为分子生物学、合成生物学及基因工程的模式菌株，其培养技术是微生物培养领域的基础与核心应用分支。

微生物培养的关键要素

1.培养基的选择：微生物培养基需碳源、氮源、无机盐、生长因子等核心营养。按物理形态分为液体培养基和固体培养基两类，按是否含抗生素等选择性药物，分为普通培养基和选择培养基。需根据微生物类型选用对应培养基（如细菌用LB培养基、酵母用YPD培养基、真菌用PDA培养基）。

2.培养条件控制：需匹配微生物的最适生长参数，如细菌通常在37℃培养、酵母在28~30℃培养；好氧菌需振荡或通气培养，厌氧菌需隔绝氧气。

3.无菌操作：所用仪器耗材需提前高温高压灭菌或者紫外灭菌处理，全程实验操作需在无菌环境下进行，避免杂菌污染，确保培养物为目标菌株。

大肠杆菌培养与分离实验指南

1.准备工作

1）试剂准备:Tryptone胰蛋白胨（Cat#70110ES）、Yeast Extract酵母提取物(Cat#70105ES)、NaCl氯化钠(Cat#60372ES)、Agar琼脂粉(Cat#70101ES)（注：配制固体LB培养基时需加入Agar琼脂粉，建议调节pH后再加入）

2）仪器耗材准备：细菌培养皿、无菌离心管、试管、锥形瓶、接种环、酒精灯、电子称、高压蒸汽灭菌锅、37℃恒温培养箱和恒温摇床等。

2.菌种复苏和接种

1）-80℃冻存的甘油菌株或者液体菌株，应置于低温或0℃冰浴中速融后划线或涂布接种至平板，或直接加入到液体培养基中进行培养（接种时挑取表面已融化部分即可，避免反复冻融导致细胞壁破裂）/斜面或半固体形式保存的菌株可直接挑取菌苔转接至平板或液体培养基中进行培养。

2）液体培养基培养条件：37℃、180–220 rpm恒温摇床，振荡培养8–12 h。

3.培养基制备

1）（以500 mL为例）称量胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠3种试剂，置于500 mL烧杯中

2）加入约400 mL去离子水，充分搅拌溶解

3）滴加5 mol/L NaOH，调节pH值至7.0

4）加入琼脂粉后充分搅拌，用去离子水定容至500 mL

5）将培养基倒入三角锥瓶，使用用耐高温组培封口膜封口（推荐使用Cat#84613ES）放入灭菌锅内。

6）所用的培养皿及接种环等耗材也需用牛皮纸包好，进行高温灭菌。

7）高温高压灭菌（121℃，20 min）

8）将所有物品放入超净台内，打开超净台的紫外灯和过滤风，待固体培养基冷却到50-60℃时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面和手，此时可向培养基添加抗生素或其他必加成分。

9）在酒精灯火焰5 cm范围内，以右手无名指及小指夹持三角瓶棉塞，右手其他3个手指拿住三角瓶中部，左手拿培养皿，并打开上盖一边(培养皿盖与培养皿呈30°～45°)，将三角瓶中培养基倒入无菌培养皿中，立即将其置于水平位置上，并轻轻晃动，使培养基铺满底部，待凝固后可4℃倒置保存备用。(根据细菌的生长状况设置平板的厚度，大肠杆菌培养基层厚度约为3~4 mm)

4.划线分离、培养与保存

1）在酒精灯火焰上灼烧接种环，将摇床上培养的菌液打开，待接种环冷却后，将接种环部分深入到菌液中。然后，在固体培养基的平板上连续划线(注:接种环只蘸1次菌液)，使得菌液以多至少的量分布在培养基表面，划线后盖好培养皿，倒置培养。

2）在37℃恒温培养箱中培养12～24 h后，可看到划线末端出现不连续单个菌落，表明菌已被分离。大肠杆菌在LB固体培养基上的菌落呈圆形、边缘整齐、表面光滑湿润、乳白色半透明。如果分离得好，培养后可观察到不连续的单菌落，这些单菌落是分别由单个细菌分裂形成的，每个单菌落上的细菌的DNA是一样的，从而达到分离不同菌的目的。

3）在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37℃培养24 h后，置于4℃冰箱中保存。（在上一步实验中，分离得到的各个单菌落可能不同，在其中选取需要进一步培养或实验的单菌落，划线接种于斜面上，低温保存，即可将该种菌独立保存下来备用。）

常见问题与解答

Q₁：超净工作台和实验室都需要开紫外灯灭菌吗？

A₁：超净工作台通常关闭玻璃门照射紫外，而因紫外线波长短，能量低，不能穿透玻璃，作用有效距离只有1.5米，故建议实验室和超净工作台都需要开紫外灯灭菌。

Q₂：菌落空白样频繁出现杂菌污染，应如何优化实验室灭菌处理？

A₂：采用紫外强度指示卡，对紫外灯的实际杀菌效能进行定量检测，确认其是否达到灭菌标准要求；紫外灯管存在固定使用寿命，需严格按照设备维护规范定期更换，避免因灯管老化导致灭菌效果衰减。

Q₃：不同保存形式的菌株分别应该如何复苏和接种？

A₃：1）冻干粉/载体保存型。

加入适量生理盐水或非选择性肉汤培养基，溶解成均匀的悬液，采用划线或涂布法接种至固体培养基，或直接吸取适量菌液至液体培养基中进行富集培养。

2）甘油/液体保存型。

建议置于低温或0℃冰浴中速融后划线或涂布接种至平板，或直接加入到液体培养基中进行培养（接种时挑取表面已融化部分即可，可避免反复冻融导致细胞壁破裂）

3）瓷珠保存型

挑取单个含菌瓷珠，在固体培养基上滚动数次或直接将磁珠加入到液体培养基中进行培养。

4）斜面或半固体培养基保存型。

可以直接挑取培养基表面菌苔，转接至固体培养基或液体培养基中进行培养。

Q₄：如何调培养基的pH值？

A₄：可采用1 mol/L NaOH溶液（用于提高pH）或HCl溶液（用于降低 pH）调节pH值，若需精细微调可使用0.1 mol/L。另外，如果调整pH值后还需高压灭菌，注意灭菌前pH值应高于所需pH 0.1-0.2个单位，此操作是为抵消高压灭菌过程中，培养基营养成分降解产酸导致的pH值自然下降。

Q₅：为什么添加琼脂粉的固体培养基出现凝固效果差/凝固分层？

A₅：1）琼脂分布不均。高压灭菌后虽从外观上看培养基澄清透明，琼脂已经完全溶解，但实际上琼脂比重大，容易集中溶解在底部，导致下层含有大量琼脂，而上层含有极少量琼脂。建议在灭菌前加热煮沸使琼脂完全溶解且分布均匀，也可在灭菌后充分摇匀。

2）环境偏酸酸性。制备pH＜4.5的培养基时，需将琼脂与其他组分分开灭菌，待各组分冷却至50~60℃左右再混合均匀制成平板。另外，培养基配制或灭菌环节出现异常，也可能导致体系pH值过低，进而引发琼脂不凝固。

Q₆：已制备的固体培养基平板可保存多久？应如何正确保存？

A₆：1）普通培养基可在适宜条件下保存2-4周。请做好密封处理：将平板倒置（防止冷凝水滴落污染培养基表面），装入无菌保鲜袋或专用培养皿盒中密封，减少水分散失与外界污染。2）严禁在0℃以下保存，结冰会破坏琼脂凝胶结构，解冻后培养基无法正常使用。3）对于含有不稳定成分的培养基平板，最好是现配现用。若保存后的培养基出现明显外观变化或污染微生物，请停止使用。

Q₇：灭菌后的琼脂培养基若未用完，可以下次再重新融化继续使用吗？

A₇：建议不要二次融化使用。

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参考文献：张泽悠，茅英莎，陆文妹.大肠杆菌的培养和分离”实验步骤的修正与优化[J].生物学教学, 2016, 41(8):43-44.