Techniques氧化应激|自由基清除实验全攻略

氧化应激（oxidative stress）是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧（reactive oxygen species,ROS）和活性氮（reactive nitrogen species,RNS）自由基产生过多，氧化程度超出氧化物清除能力，氧化系统和抗氧化系统动态失衡，从而导致细胞和组织损伤的一种状态。研究表明机体内氧化还原水平失衡导致的氧化应激是众多疾病的病理生理基础，防御氧化应激，主要依靠机体内的抗氧化体系。根据清除机制的不同，抗氧化体系大致可分为两个系统：酶抗氧化系统和非酶抗氧化系统。

体系内各种抗氧化大分子、小分子和酶的总水平，反映了该体系内的总抗氧化能力（T-AOC）。T-AOC能更全面地评价体液、细胞和组织匀浆、食品和饮料的抗氧化剂含量，广泛应用于医学、食品科学等相关研究。

图1 自由基和抗氧化剂之间的不平衡导致氧化应激（图源百度）

即二苯基苦基苯肼，DPPH是一种稳定的氮中心显色自由基，在517nm波长处产生特征吸收峰。样本中的抗氧化物质会使DPPH的吸光度减小直至消失，其吸光度的变化量在一定区间内与抗氧化物质含量呈线性关系。

即2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，又称TEAC法，ABTS与适当氧化剂作用后，会生成蓝绿色的ABTS阳离子自由基（ABTS•+），在734nm波长处产生特征吸收峰，当抗氧化物质存在时，ABTS•+的生成会受到抑制，使吸光度降低。与Trolox标准对照体系相比较，就能计算出样本的总抗氧化能力（TEAC值）。

即FRAP法（ferric reducing antioxidant power），即在酸性条件下，Fe3+-TPTZ被样本中的抗氧化物质还原为蓝色的Fe2+-TPTZ，并在593nm波长处产生特征吸收峰。以Fe2+为标准，通过吸光度的大小，可以计算样本的抗氧化能力。FRAP法测定步骤简单，速度快，但其本质是以Fe2+进行等量替代的计算方法，反应本身并不具备抗氧化能力的生物学相关性。

抗氧化能力的评价方法，因检测原理、反应条件等的不同而多种多样，每一种方法都有其适用范围和特点。

目前，还没有哪一种方法能够全面地评价出样本的总抗氧化能力。实验中，往往需要至少两种方法同时测定。对于具体样本，应根据分析条件和作用底物等因素，综合选择相应的检测方法。

DPPH法、FRAP法和 ABTS法较为简便易行，但DPPH、ABTS的化学性质使其偏离生物环境较远；FRAP法和ABTS法在结果上具有很好的相关性与一致性，尤其是在成本和操作上，具有明显的比较优势。

1. DPPH反应液配制：准确称取0.0039 g DPPH试剂（Yeasen Cat.NO 60310ES）溶于乙醇中，室温避光下搅拌2 h，定容至100 mL[1]；

2. 检测方法：将样品与DPPH以1：9的体积比混匀，室温避光反应30 min后，在517 nm处测定吸光值；

3. 结果表示：以Trolox（Yeasen Cat.NO 60309ES）当量测定抗氧化能力。

1.ABTS反应液配制：ABTS（Yeasen Cat.NO 60328ES）溶于pH值为4.5的醋酸钠溶液中配制7.4 mmol/L的ABTS溶液，并将ABTS与2.6 mmol/L的过硫酸钾溶液以1：1体积比混匀，室温下避光静置12 h[2] ；

2.检测方法：将样品与反应液以1：9的体积比混匀，避光反应30 min后，734nm检测吸光度；

3.结果表示：以Trolox（Yeasen Cat.NO 60309ES）当量测定抗氧化能力。

1. FRAP反应液配制：将TPTZ（Yeasen Cat.NO 60329ES）溶于40 mmol/L HCl 配制7 mmol/L的A工作液，并分别制备20 mmol/L的FeCl3（B工作液）和300 mmol/L的pH为3.6醋酸钠溶液（C工作液），将A: B: C体积比为10:1:1混匀得FRAP工作液。

2. 检测方法：配制浓度为0.031~4mM的FeSO4标准溶液。将各浓度标准溶液与工作液分别以1：29的体积比混匀，避光反应15 min后，在593 nm处测定吸光值，绘制吸光值与FeSO4浓度标准曲线。

3. 结果表示：将样品与FRAP反应液混匀后测定其吸光值，样品的FRAP自由基清除能力用FeSO4当量浓度表示[3]。

[1] Hui T,et al.Food and Chemical Toxicology.129(2019)138-143.

[2] Leyla Pa,sayeva,et al.Antioxidants 2022, 11, 2284.

[3] Thaina Omia Bueno-Pereira,et al.Antioxidants 2022,11,2111.