Article Detail

技术讲解告别克隆低效困境！精准限制性内切酶让您的重组实验“切”半功倍！

📂 产品解读类型 ID 5006

👁 21,997 次浏览 🗓 2026-10-12 源站内容 ID：1961312607281885184

限制性内切酶（又称限制酶），是一种能精准识别并切割双链 DNA 特定核苷酸序列的酶类。自 1965 年首次发现后，其精准性、稳定性持续升级，从早期天然酶到 2010 年高效工程酶的突破，推动了分子克隆从传统酶切连接迈向自动化精准组装。作为 “分子剪刀”，它可按实验设计定向切割目的基因与载体，为分子克隆、mRNA 质粒线性化等多领域应用奠定了基础。本文将解析其

来源：翌圣生物｜原文：https://www.yeasen.com/solutiondetail/1961312607281885184 ↗

图1. 限制性内切酶发展史^[1]

分子克隆技术是分子生物学核心，其发展为生命科学带来革命性突破，支撑着基因克隆与表达、病毒包装与基因治疗、细胞治疗、蛋白质组学研究、基因敲除、药物筛选、农业育种等多领域发展。

近年来，分子克隆技术历经多轮迭代升级，形成了多元化技术体系：一步法克隆凭借 “快速便捷” 的显著优势成为主流选择；Gold Gate 克隆依托多酶切 - 连接的精准调控机制，成为复杂载体构建的首选方案；而传统的粘性末端 / 平末端克隆，因操作简便、成本可控的特性，至今仍是基础克隆实验中的重要手段。接下来，我们将逐一解析限制性内切酶在这三类主流克隆技术中的核心应用。

一步法克隆：快速重组的核心工具

原理：先通过限制性内切酶酶切或 PCR 制得线性化载体，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在同源重组酶（T5 Exonuclease 切割5’末端形成粘性末端，DNA聚合酶将15-25 bp的同源序列补齐，Taq DNA Ligase 连接缺口）的作用下，经过一定的时间和温度即可进行转化，完成定向克隆。
应用：依托限制性内切酶的特异性切割，适用于1-5片段快速重组，如目的基因克隆、质粒载体构建，广泛用于基因功能研究、蛋白质表达载体构建等基础科研。

图2. 一步法克隆技术原理图

Gold Gate 克隆：多片段组装的精准调控

原理：先通过 PCR 在目的片段两端引入 IIs 型限制性内切酶（如 BsaI、BsmBI）的识别序列，再用该酶特异性识别并切割目的片段与载体的酶切位点（切割位置在识别序列外侧），随后在连接酶作用下实现目的片段与载体的无缝连接（可单片段或多片段重组，优化条件下能组装超 20 个 DNA 片段），最后将重组产物转化涂板并鉴定阳性克隆。
应用：依托 IIs 型限制性内切酶的精准切割特性，适用于复杂载体构建场景，在多片段 DNA 组装、基因回路构建等分子克隆相关研究中发挥重要作用，满足科研中对多片段精准重组的需求。

图3. Gold Gate克隆技术原理图^[3]

粘性末端 / 平末端克隆：基础克隆的经典高效方案

原理：先通过 PCR 扩增获得目的 DNA 片段，再用限制性内切酶分别切割目的片段与载体，使其产生互补的粘性末端（含单链突出区）或平末端（无突出区），随后在连接酶作用下将目的片段与载体连接形成重组载体，最后将连接产物转化至宿主细胞，经涂板培养与阳性克隆鉴定得到目标重组载体。
应用：依托限制性内切酶的特异性切割，因操作简便、成本可控，至今仍是基础克隆实验的重要手段，适用于基础科研中的常规目的基因克隆、简单载体构建等场景。

图4. 粘性末端 / 平末端克隆技术原理图

以上三种技术共同构成了当前分子克隆的核心方法体系，值得注意的是，以上三种克隆技术的高效运用，都离不开限制性内切酶的关键协助。作为中国分子酶领域的领军企业，翌圣生物成功攻克限制性内切酶的“卡脖子”难题，目前翌圣FuniCut^®快速限制性内切酶已实现：

✅ 精准酶切：媲美进口品牌，且兼容其缓冲液，即使过夜酶切，星号活性也极低。

✅ 方便快速：5-15min快速酶切，通用缓冲液。

✅ 操作简便：提供红色Color缓冲液，酶切产物可直接点胶电泳。

✅ 供应链保障+成本双赢：国产化生产，摆脱断供风险。

性能展示

酶切效果媲美进口品牌，并且与其buffer兼容性好

图5. 翌圣FuniCut^® BamHI酶切效果与进口品牌同类型产品相当，并且与N*、T*品牌的buffer兼容性好

在FuniCut^® Buffer中，5 min完成单、双和三酶切

图6. 在通用的FuniCut^® Buffer中，5 min可完成单、双和三酶切，如EcoRI+KpnI+SmaI三酶切

通过严格的对比数据，翌圣生物的限制性内切酶在酶切效果、酶切速度和星号活性等性能均能媲美国际品牌，且翌圣生物FuniCut^®系列限制性内切酶兼容进口品牌buffer，可实现无缝替换。我们为您提供以下全系列产品清单，覆盖常规科研、诊断与工业化需求，助您无缝替换进口酶，无需改变实验流程，即可获得一致甚至更优的酶切效果。

常用限制性内切酶选择指南

产品货号	产品名称	酶活(U/μL)	规格(T)	识别序列
15003ES76	FuniCut® BamHI	20	500T	5'-G↓GATCC-3' 3'-CCTAG↑G-5'
15005ES50	FuniCut® BsaI	20	50T	5'-GGTCTC(N)1↓-3' 3'-CCAGAG(N)5↑-5'
15010ES78	FuniCut® EcoRI	20	600T	5'-G↓AATTC-3' 3'-CTTAA↑G-5'
15012ES76	FuniCut® HindIII	100	500T	5'-A↓AGCTT-3' 3'-TTCGA↑A-5'
15015ES70	FuniCut® KpnI	100	200T	5'-GGTAC↓C-3' 3'-C↑CATGG-5'
15018ES30	FuniCut® NcoI	20	30T	5'-C↓CATGG-3' 3'-GGTAC↑C-5'
15020ES30	FuniCut® NheI	20	30T	5'-G↓CTAGC-3' 3'-CGATC↑G-5
15021ES50	FuniCut® NotI	20	50T	5'-GC↓GGCCGC-3' 3'-CGCCGG↑CG-5'
15023ES60	FuniCut® SacI	20	100T	5'-GAGCT↓C-3' 3'-C↑TCGAG-5'
15024ES70	FuniCut® SalI	20	200T	5'-G↓TCGAC-3' 3'-CAGCT↑G-5'
15028ES50	FuniCut® Spel	20	50T	5'-A↓CTAGT-3' 3'-TGATC↑A-5'
15033ES76	FuniCut® XbaI	20	500T	5'-T↓CTAGA-3' 3'-AGATC↑T-5'
15034ES76	FuniCut® XhoI	20	500T	5'-C↓TCGAG-3' 3'-GAGCT↑C-5'
15041ES25	FuniCut® PacI	10	25T	5'-TTAAT↓TAA-3' 3'-AAT↑TAATT-5'
15048ES30	FuniCut® Esp3I (BsmBI)	10	30T	5'-CGTCTC(N)1↓-3' 3'-GCAGAG(N)5↑-5'
15052ES50	FuniCut® DpnI	20	50T	5'-GAm6↓TC-3' 3'-CT↑Am6G-5'
15056ES25	FuniCut® AgeI	20	25 T	5'-A↓CCGGT-3' 3'-TGGCC↑A-5'

除以上常用限制性内切酶产品，翌圣现有超100种限制性内切酶，满足超90%常用需求。戳常用限制性内切酶选择指南（含酶切位点、同裂酶、甲基化）或扫描下方二维码，即可获取翌圣限制性内切酶全系产品资料，文件包含：货号、产品名称、酶活、切割位点、buffer兼容活性等信息。

其他分子克隆相关产品推荐

产品类型	产品名称	货号
一步法克隆试剂盒	Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit	10923ES
TOPO克隆试剂盒	Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit	10906ES
PCR mix	2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix	10167ES
高保真酶	Hieff Canace® Long PCR Master Mix (With Dye)	10166ES
DNA连接酶	Hieff® Gold T4 DNA Ligase	10300ES
DNA连接酶	Taq DNA Ligase	11051ES
T5核酸外切酶	T5 Exonuclease	14538ES
TOPO异构酶	Topoisomerase I	14971ES
感受态细胞	DH5α Fast Chemically Competent Cell F DH5α化学感受态	11803ES
核酸染料	YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)	10202ES
琼脂糖	Agarose	10208ES
DNA marker	GoldBand DL2000 DNA Marker	10501ES

参考文献
[1] Di Felice F, Micheli G, Camilloni G. Restriction enzymes and their use in molecular biology: An overview[J]. Journal of biosciences, 2019, 44(2): 38.
[2] Johansson S. The use of Gibson Assembly for DNA cloning[J]. 2022.
[3] Biró J B, Kecskés K, Szegletes Z, et al. Golden EGG, a simplified Golden Gate cloning system to assemble multiple fragments[J]. Scientific Reports, 2024, 14(1): 25288.

来源与原文

来源： 翌圣生物

原文链接： https://www.yeasen.com/solutiondetail/1961312607281885184

源站内容 ID：1961312607281885184

本站内容整理自翌圣生物官网公开资料，版权归原作者所有；如涉版权问题请联系本站删除。

本篇涉及的产品关联来自源站内容