Techniques外泌体样本制备超全指南及产品应用

这是最基础的样本类型，培养基的选择是成败关键。严禁直接使用含标准血清的培养基，因为FBS中含有大量牛源外泌体，会严重干扰实验结果。

制备流程：

1、细胞准备：贴壁细胞长至 70%-80% 融合度，悬浮细胞密度 60%-70%。

2、换液诱导：

贴壁细胞：弃旧液，PBS 冲洗去除血清，换用无外泌体培养基或外泌体专用无血清培养基；

悬浮细胞：300g、4℃、10min 收集后，更换无外泌体培养基或外泌体专用无血清培养基。

3、收集上清：在换液后继续培养24-48小时，收集细胞上清。

4、预处理除杂：300×g，4℃，离心 10 分钟，去除活细胞。

5、转移上清：3000×g，4℃，离心 15 分钟，去除死细胞和碎片。（可选）使用 0.22 μm 滤膜过滤，进一步去除大颗粒。

6、保存：最好直接进行外泌体提取，或分装冻存于-80℃，长期保存可能导致产量下降。

关键事项：

➡ 换液后细胞需明显增殖，同时避免过满凋亡导致外泌体降解

➡ 收集后立即离心除杂，再冻存

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全血不可直接提取，必须先分离血清和血浆，血液样本极易受溶血和血小板污染影响，推荐优先使用血浆，发生溶血的样本应丢弃。

制备流程：

1、采血

血浆：空腹采血，使用EDTA抗凝管，轻柔颠倒混匀，室温1小时或者4℃下2小时内处理。

血清：收集不加抗凝剂的全血2mL，加入促凝管中，室温1小时或者4℃下2小时内处理。

2、初次离心：4℃，1900-2500×g，离心10-15分钟。小心吸取上清（血浆），弃去最后约 0.5 mL（避免吸入底层细胞）。

3、二次离心：将上清转移至新管，4℃，3000×g，离心10分钟。

4、分装保存：吸取最终上清，按0.5-1 mL/管分装，立即冻存于-80℃冰箱。

关键事项：

全血: 通过采血管采集后，经过抗凝处理的全部血液。

血浆: 经过抗凝处理的全血，进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体。

血清: 不经过抗凝处理的血液，让它自行凝固，再进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体。

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1. 取中段晨尿20-100mL，4℃临时保存（不超过8小时）。

2. 离心：300g，4℃，10min → 取上清 → 3000g，4℃，15min → 取上清冻存。

1、新鲜采集乳液，前2 mL左右乳液应弃去，收集至少5 mL，于4℃临时保存(不得超过8 h);

2、300 g，4℃，离心10 min，去除细胞等杂质;

3、3000 g，4℃，离心15 min，去除细胞碎片等杂质;

4、-80℃冰箱中保存，记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

2、-80℃冰箱中保存，记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

1、对于冻存的细菌培养上清，室温或25℃水浴解冻，将完全融化的样品置于冰上；

2. 对于新鲜的细菌培养上清，收集样品后置于冰上，5,000×g，4℃离心20 min，将上清液转移至新的离心管中，再次5,000×g，4℃离心 20 min彻底去除细菌和细菌碎片，收集上清液(若上清液pH＜7.0，需用0.5M/LNaOH调pH至7.0~7.4)，待用。

通用要求：新鲜、完整、0-4℃冷藏，24h内送达。

各类别送检量：

• 果实类（柠檬等）：3-5个（200-300g）

• 花/叶类（玫瑰等）：5-10片

• 根茎类（山药等）：1-2个整根（200-300g）

• 干品类（金银花等）：20-30g

• 大型真菌（灵芝等）：1-2整朵（100-150g） 0-4℃冷藏运输 果实/花叶/根