Question Detail
After grinding tumor tissue blocks, single cells stained with Annexin V/PI show many fragments. How should gating be performed?
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How to Answer This Question
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1
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Read the full description, category and tags to understand the real scenario.
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2
Give an Actionable Answer
Give concrete steps, cautions and reasoning — not just a conclusion.
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Reference standards, papers or product manuals to make the answer more credible.
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All Answers4
林
林佳佳
2026-09-15
多数凋亡试剂盒的 binding buffer 是浓缩型，说明书会写 5× 或 10×，需要稀释成 1× 使用；如果是即用型，瓶身会直接标 1×。不要用普通 PBS 替代，因为 Annexin V 结合依赖钙离子，PBS 可能缺少合适钙浓度。动物组织单细胞悬液我常用：温和机械研磨 + 胶原酶 IV/DNase I，40 μm 过滤，必要时用 30%-40% Percoll 密度梯度离心去除碎片和死细胞，但要注意密度梯度离心可能丢失部分早期凋亡细胞，需根据实验目的评估。
B
BufferOne
2026-09-17
组织来源做 Annexin V/PI，染色时间和洗涤次数可以按说明书走，但上游处理更关键。研磨时别用太大力，建议用一次性 40 μm 滤网过滤，或机械研磨后加胶原酶/DNase I 消化残余组织，减少结团和游离 DNA。过滤后离心洗 2-3 次，最好用含 1%-2% 血清或 BSA 的缓冲液洗，能减少碎片黏附。洗涤次数增加会损失细胞，但组织样本背景高时多洗一次通常利大于弊。最后重悬到 binding buffer 前，确认没有 EDTA 残留。
P
PCR706
2026-08-13
一次染色到底需要多少细胞，组织来源要比细胞系多准备。建议每管上机前准备 5×10^5-1×10^6 个活细胞，如果从肿瘤块开始，因为碎片和损耗，起始细胞量最好留 2-3 倍；同时还要为未染、FITC 单阳、PI 单阳留管。组织块的大小不好统一，但一般几十毫克肿瘤组织研磨后有效活细胞可能只够 1-2 管，所以多合并几个小块或增加起始量更稳妥。
B
Bio
2026-09-03
肿瘤组织研磨后的碎片确实多，圈门先别急着在 FITC/PI 图上拉象限。建议先在 FSC/SSC 上圈形态完整的主细胞群，左下角碎片不要圈；再用 FSC-H 和 FSC-A 去双联体，因为肿瘤组织很容易成团。之后再看 Annexin V-FITC/PI，以未染管和单阳管确定荧光阈值。组织样本坏死细胞多，PI 阳性会偏高，不要把 PI 单阳区域直接等同于晚期凋亡，最好结合 FSC/SSC 形态和对照判断。圈门时避免把主群切得太窄，否则会丢失早期凋亡细胞。
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